Le cellule mononucleari tonsillari sono più rilevanti e complesse delle cellule del sangue e il loro isolamento consente lo studio della risposta delle cellule immunitarie in patologie che coinvolgono l'immunità mucosa. La tecnica che abbiamo stabilito consente il recupero di un gran numero di cellule immunitarie da un tessuto mucoso mantenendo la loro integrità per gli studi ex vivo. Il metodo è abbastanza semplice, ma le tonsille devono essere maneggiate rapidamente e con cura al fine di massimizzare la resa.
Trasportare il tessuto tonsillare umano in laboratorio come descritto nel testo manoscritto. Quindi, posizionare il filtro cellulare su un piatto di coltura da 150 per 25 millimetri. Mettere tutti gli strumenti di dissezione in un altro piatto per mantenerli sterili.
Tutti i tuoi campioni principali devono essere maneggiati con cura in quanto non sono stati precedentemente qualificati e possono contenere agenti infettivi. Quindi versare il PBS dal flaconcino in un colino, perché conterrà alcune cellule che hanno uscita le tonsille. Utilizzando forcep sterili, trasferire le tonsille dal flaconcino nel piatto di coltura usando forcep sterili.
Se necessario, aggiungere più PBS per immergere la griglia. La dissezione richiederà circa 45 minuti per tonsille. È fondamentale che durante questo periodo le tonsille siano sommerse per garantire una buona vitalità e rese cellulari.
Rimuovere il tessuto cauterizzato insanguinato e fibroso usando le forcep e un bisturi. Usando il bisturi e le pinzette curve, tagliare il tessuto in piccoli pezzi di meno di mezzo centimetro di diametro. Tagliare tutto il tessuto in modo che i piccoli pezzi possano essere immersi in ogni momento.
Posizionare alcuni pezzi di tessuto nel filtro cellulare. Raschiali sulla griglia con un pestello di vetro fino a quando rimane solo uno strato molto sottile di stroma bianco. Rimuovere e scartare lo stroma per evitare di intasare la griglia.
Quindi utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire la sospensione cellulare sulla griglia e raschiarla un'ultima volta. Successivamente, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire la sospensione cellulare in una fiala sterile. Lavare una volta la griglia e il filtro cellulare con PBS e trasferire anche il PBS al flaconcino.
Prima di procedere lasciare riposare la sospensione cellulare sul banco per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare un setaccio sterile di 70 micrometri sopra una nuova fiala da 50 millilitri. Trasferire delicatamente la sospensione cellulare sul setaccio con una pipetta da 10 millilitri.
Se il setaccio è intasato, utilizzare la parte posteriore di una punta sterile di pipetta da un millilitro per raschiare le cellule attraverso il setaccio. Cambiare il setaccio tutte le volte che è necessario. Centrifugare le cellule a 250 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet toccando delicatamente il flaconcino, quindi sospendere di nuovo le celle in 35 millilitri di PBS. Per completare la prima fase di isolamento cellulare, posizionare un nuovo setaccio di 70 micrometri sopra un nuovo flaconcino e trasferire la sospensione cellulare su di esso con una pipetta da 10 millilitri.
Per ottenere una soluzione cellulare più chiara, iniziare aggiungendo 15 millilitri di un mezzo gradiente di densità a una nuova fiala da 50 millilitri. Versare la soluzione TMC sopra il mezzo gradiente di densità, facendo attenzione a ridurre al minimo la miscelazione. Quindi, centrifugare la soluzione a 1000 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente con accelerazione e freno spento.
Dopo aver rimosso il flaconcino dalla centrifuga, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per rimuovere e scartare lo strato superiore. Non disturbare l'interfaccia tra i TMC e il mezzo gradiente di densità. Quindi rimuovere i CTMC con la punta sterile della pipetta da un millilitro e trasferirli in una nuova fiala da 50 millilitri.
Per lavare le cellule, aggiungere prima 50 millilitri di PBS contenenti il 2% di siero bovino fetale e 2 EDTA millimolare. Quindi centrifugare il tubo a 250 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare di nuovo le cellule, ma questa volta centrifugare il tubo a 400 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Preparare il terreno di coltura R10 integrando RPMI 1640 con FBS inattivato dal calore al 10%, 2 l-glutammina millimolare e la soluzione antibiotica. Sospendere di nuovo i MTM in 10 millilitri di R10. Quindi conta le celle.
Le cellule possono essere utilizzate immediatamente o congelate per un uso futuro come descritto nel manoscritto. I MTM sono stati macchiati, incubati con anticorpi e caratterizzati utilizzando citometria a flusso. I MTM contenevano tutti i principali tipi di cellule immunitarie presenti nelle cellule mononucleari periferiche dal sangue, abbreviato PMBC.
Tuttavia, le frequenze di tutti i tipi di cellule, ad eccezione delle celle B, erano più basse nei MTC che nei PBPC. Per studiare l'attivazione cellulare nella produzione di citochine, i MTC sono stati stimolati durante la notte con resiquimod R848. I CTMC, tracciati in blu, producevano tutte le citochine testate ad eccezione di IFN Lambda 2/3 e IL-8, sebbene la produzione fosse inferiore a quella dei PBPC, tracciati in verde.
La piega aumenta confrontando la stimolazione R848 con nessuna stimolazione si nota in rosso. I TMC purificati e isolati, i blocchi di tessuto blu e tonsillare, arancione, sono stati stimolati per 24 ore con il virus influenzale A, IAV. La produzione di IFN è stata rilevata nei TMC ma non nel supernatante dei blocchi tissutali indicando che le espianto tissutali non sono il modello migliore per lo studio della secrezione di citochine e dell'attivazione cellulare.
Dopo la pre-incubazione con il farmaco tossico C1 e la stimolazione con R848, TMC e PBPC sono stati saggiati per la vitalità. I CTC erano più sensibili al C1. Ciò suggerisce che nuovi farmaci nei futuri trattamenti dovrebbero essere testati nelle cellule dei tessuti, non solo sulle linee cellulari, sui PBPC o sugli espianto tissutale. Questa procedura ci consente di utilizzare i MTMC come i PFC di sangue intero e di eseguire gli stessi esperimenti cellulari come la purificazione di uno specifico tipo di cellula, la coltura cellulare, la citometria del flusso o il congelamento.
Gli isolamenti dei TMC consente di caratterizzare meglio, in un modello pertinente, la risposta immunitaria negli organi linfoidi secondari in patologie che coinvolgono l'immunità mucosa.
