Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Lundbeck, dalla NOVO-Nordisk Foundation, dal Danish Council for Independent Research. Scienze Mediche, e la Fondazione NORDEA Grant al Centro per l'invecchiamento sano.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato etico nazionale danese secondo le linee guida stabilite nella Convenzione del Consiglio europeo per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e di altro tipo e rispettavano le linee guida di ARRIVE. Questa è una procedura terminale con i topi che vengono eutanasiati prima del recupero anestetico.
1. Preparazione pre-chirurgica
<ol><li>Pulire la tavola chirurgica e tutta l'area circostante con il 70% di etanolo. Pulire e asciugare accuratamente gli strumenti chirurgici prima dell'intervento.</li>
	<li>Anestesizzare un topo NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; entrambi i sessi; 4-8 mesi) da un'iniezione peritoneale di ketamina - xylazina (60 mg/kg - 10 mg/kg) disciolto acqua sterilizzata, pH 7.4. Somministrare dosi supplementari di chetamina (30 mg/kg) ogni 25 min fino al completamento della procedura chirurgica. Controllare regolarmente i riflessi della coda e del pizzico delle dita dei dei dei dei dei dei dei dei dei pipimi per verificare la profondità dell'anestesia.</li>
	<li>Iniettare la salina sottocutanea in quattro posizioni diverse sul retro del mouse per un volume totale di 1 mL per prevenire la disidratazione durante l'esperimento. Per proteggere gli occhi dall'essiccazione, applicare il lubrificante per gli occhi. Mantenere la temperatura corporea a 37 gradi centigradi utilizzando una sonda a temperatura rettale e una coperta riscaldante.</li>
</ol>2. Procedura chirurgica
<ol><li>Tracheotomia
	<ol>
<li>Posizionare il mouse sulla schiena. Iniettare 0,04 mL dello 0,5% di lidocaina sotto l'incisione pianificata e attendere 2 min. Separare le ghiandole submandibolare e i muscoli sternotroidi, quindi esporre la trachea.</li>
		<li>Fare la tracheostomia tra due anelli tracheali con le forbici. Inserire un piccolo tubo metallico con una lunghezza di 16,2 mm e un diametro di 1 mm nella trachea. Collegare il tubo a un ventilatore meccanico e a un capnografo per monitorare il CO2 espiratorio finale (Figura1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Inserimento catetere
	<ol>
<li>Iniettare 0.5% lidocaina (0.04 mL) sotto l'incisione prevista e attendere 2 min.</li>
		<li>Utilizzando pinze punta fine separare delicatamente l'arteria dalla vena. Fermare il flusso sanguigno a monte con un morsetto microvascolare. Costringi il flusso sanguigno a valle con una sutura di nylon 10-0 che lega entrambi i vasi sanguigni.</li>
		<li>Utilizzare forbici micro-dissettive per fare una piccola incisione sia nell'arteria che nella vena. Inserire cateteri di plastica in entrambi i vasi sanguigni. Fissare i cateteri stringendo le suture (8-0 o 10-0 suture di nylon dipendenti dalle dimensioni del vaso) senza compromettere i lumami del catetere. Rimuovere il morsetto microvascolare e chiudere la pelle.</li>
		<li>Monitorare la pressione sanguigna tramite il catetere arterioso. Misurare i livelli di gas ematici nei campioni di sangue arterioso (50) prima e dopo ogni esperimento (valori normali: pO2, 90-120 mmHg; pCO2, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45) utilizzando un analizzatore di gas sanguigno. Utilizzare il catetere della vena per l'infusione di fluoresceina e anestesia.</li>
	</ol></li>
	<li>Craniotomy
	<ol>
<li>Rasare la pelliccia dalla testa del topo tra le orecchie. Iniettare 0,04 mL dello 0,5% di lidocaina sotto l'incisione pianificata e attendere 2 min.</li>
		<li>Pulire il cranio utilizzando una soluzione di cloruro di ferro al 10% per rimuovere il periosteo. Sciacquare accuratamente il cranio con la salina. Incollare una barra di testa metallica al cranio con colla e attivatore di cianoacrita (Figura 1A). NOTA: La barra della testa metallica è lunga 75 mm e larga 13,5 mm, con un foro rotondo di 5 mm di diametro al centro.</li>
		<li>Forare una craniotomia di 4 mm di diametro, centrata a 0,5 mm dietro e 3 mm a destra della bregma sulla corteccia della canna sensoriale destra. Rimuovere la dura con un dilatatore a punta fine.</li>
		<li>Coprire la corteccia esposta con gel di agarose dello 0,75%, disciolto nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; pH 7,4) e raffreddato a 35 gradi centigradi. Coprire l'80-90% della craniotomia con un coperchio di vetro con un angolo di 10-15 gradi rispetto alla barra di testa metallica (Figura 1B) che consente l'inserimento e il posizionamento della micro-pipetta di vetro.</li>
		<li>Per ridurre al minimo la pulsazione cerebrale, incollare i due angoli del coperchio di vetro sulla barra della testa metallica con colla cianoacrilata e attivatore. Applicare l'attivatore con attenzione per evitare di entrare nel cervello esposto. Sciacquare il coperchio di vetro incollato accuratamente con salina in seguito.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'inserimento della sonda di stimolazione del pad del baffo. Inserire una serie di elettrodi bipolari su misura (lunghezza 8 mm e spessore di 0,25 mm) percutaneamente nel lato sinistro del viso per stimolare il ramus infraorbitalis del nervo trigeminale contraplaterale alla craniotomia. Posizionare il catodo vicino alla pausa infraorbitalis e inserire l'anodo nei muscoli masticatori7. Eseguire la stimolazione con uno stimolatore elettrico ad un'intensità di 1,5 mA per 1 ms in treni di 20 s a 2 Hz.</li>
	<li>Al termine dell'intervento, somministrare un bolo di isotoniociocionano-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, peso molecolare [MW] 50.000) nella vena femorale per etichettare il plasma sanguigno. Interrompere la chetamina e passare l'anestesia a infusione endovenosa continua di z-cloralo (17% w/v, concentrazione finale) mescolata con FITC-dextran (2% w/v, concentrazione finale) a 0,02 mL/10 g/h. Attendere circa mezz'ora per la stabilizzazione del nuovo stato anestetico. NOTA: sia fitC-dextran che cloralo sono dissolti nello 0,9% salino.</li>
</ol>3. Prima sessione di imaging a due fotoni
<ol><li>Trasferire il mouse allo stadio di un microscopio commerciale a due fotoni (Tabella dei Materiali). In entrambi i modi di illuminazione epi-fluorescente, in base alle proteine fluorescenti rosse (RFP, Figura 1C) e alle proteine fluorescenti verdi (GFP, Figura 1C)dell'illuminazione epifluorescente, scattare una foto della corteccia esposta con un obiettivo 5x. Utilizzare l'immagine RFP come una "mappa" per l'inserimento della micropipetta di vetro nella sessione successiva. NOTA: La "mappa" GFP viene utilizzata per distinguere le vene/venule dalle arterie/arteriole.</li>
	<li>Eseguire l'imaging a due fotoni utilizzando il microscopio a due fotoni e un obiettivo di immersione dell'acqua 25x 1.0 di apertura numerica (NA) con motore piezo. Impostare la lunghezza d'onda dell'eccitazione su 900 nm. Cerca la corteccia e segui ogni arteriola penetrante e trova i suoi rami orizzontali (1 capillaridi ordine).</li>
	<li>Immagini penetranti arteriole e loro capillari di ordine 1st a riposo e durante la stimolazione del baffo. Vedere i parametri di imaging dettagliati nella sezione 5.</li>
	<li>Contrassegnare le posizioni di 1st ordine capillari con >5% vasodilazione durante la stimolazione del pad baffo sulla RFP 'mappa' (Figura 1C). Le località con vasodialamento <5% sono considerate al di fuori della regione della corteccia della canna del baffo. NOTA: Se si utilizzano topi di tipo selvaggio invece di topi rossi NG2D nell'esperimento, l'immagine GFP viene invece utilizzata come "mappa".</li>
</ol>4. Inserimento della micropipetta di vetro
<ol><li>Preparare micro-pipette di vetro per sbuffare utilizzando un estore di pipette (Tabella dei materiali). Le micropipette in vetro hanno una resistenza di 3-3,5 M e una lunghezza di coniatura di 4,5-5 mm. Caricare una pipetta con una miscela di 1 mM ATP e 10 Alexa 594 al fine di visualizzare la punta della pipetta sotto la lampada epi-fluorescente e il microscopio a due fotoni.</li>
	<li>Montare la micropipetta di vetro su un supporto per morsetti e collegarla a una pompa ad aria. Impostare la pressione di tenuta della pompa a 0 psi.</li>
	<li>Utilizzando l'illuminazione epifluescente rossa, concentrarsi sulla punta della pipetta con l'obiettivo 5x. Collocare la micropipetta di vetro nell'aCSF sopra l'agarose. Regolare la pressione di tenuta della pompa d'aria a 0,2 psi. Una piccola nuvola rossa può essere osservata espellere dalla punta della pipetta nell'ACSF. Questo per evitare intasamenti durante l'inserimento della pipetta.</li>
	<li>Scegliere una delle posizioni contrassegnate nella "mappa" della richiesta di offerta come destinazione. Spostare la punta della pipetta sul piano orizzontale del bordo del vetro di copertura con una distanza di 30 m, indicando approssimativamente verso la destinazione nel piano x-y.</li>
	<li>Abbassare con attenzione la punta della pipetta nell'asse z sotto lo slittamento del vetro di copertura. Quindi iniziare a far avanzare la pipetta di vetro verso la destinazione fino a 500 m sopra la superficie del cervello. Spostare spesso la messa a fuoco tra il bordo del vetro di copertura, la punta della pipetta e la superficie del cervello, assicurandosi che ci sia abbastanza spazio libero per spostare la pipetta.</li>
	<li>Impostare l'obiettivo su 25x. Ricentrare la punta della pipetta e far avanzare ulteriormente la punta della pipetta verso la destinazione sulla "mappa" RFP. Mantenere la punta della pipetta nello strato di agarose.</li>
	<li>Quando la punta della pipetta è di 100 m sopra la superficie del cervello, passare alla microscopia a due fotoni. Concentrarsi su una posizione di destinazione in cui sbuffare. Scrivere le coordinate x, y (x0, y0) e la profondità sotto la superficie (z0). Calcolare le coordinate del punto di inserimento sulla superficie del cervello (xi, yi) come segue: xi - x0 x z0 / tan yi : y0 dove è l'angolo tra il supporto della pipetta e il piano orizzontale.</li>
	<li>Posizionare la punta della pipetta sulle coordinate (xi, yi) sulla superficie del cervello. Inserire delicatamente e lentamente la pipetta fino a raggiungere (x0, y0, z0). Se un recipiente ha la direzione di un percorso di inserimento, ritirare la pipetta e ricalcolare altre coordinate e percorso di inserimento; o ruotare leggermente la piastra dello stage (come indicato nella figura 1A).</li>
	<li>Impostare la pressione di tenuta della pompa a 0 psi e la pressione di espulsione a 10-15 psi. Puff ATP per 200-400 ms nella posizione di destinazione durante l'imaging a due fotoni. Regolare la pressione e la durata di sbuffare per ogni pipetta e nel tempo come spiegato nella sezione di discussione.</li>
</ol>5. Immagini hyperstack a due fotoni
<ol><li>Eseguire esperimenti utilizzando il microscopio a due fotoni e un obiettivo di immersione dell'acqua 25 x 1,0 NA con motore piezo. Impostare la lunghezza d'onda dell'eccitazione su 900 nm. Filtrare la luce emessa per raccogliere la luce rossa da DsRed (periciti)/tetramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) colorando plasma sanguigno e luce verde da FITC-dextran (plasma sanguigno)/GCaMP6 (GFP, calcio astrocitico).</li>
	<li>Produrre uno z-stack ad alta risoluzione nella posizione di interesse contenente un arteriolo penetrante, un capillare di 1st ordine, un 2nd ordine di cellule fluorescenti e possibilmente vicine (ad esempio, periciti, astrociti). Determinare il più possibile il volume di immagini iperimpilate di x-yz includendo la struttura 3D dei vasi sanguigni. L'altezza totale di ogni pila può variare da 30-50 m, mentre il piano x-y copre approssimativamente un'area di 60 m x 40 m.</li>
	<li>Impostare la pila di immagini nel software di imaging in modo che sia composta da 8-10 piani con una distanza tra piani di 4-5 m. L'obiettivo piezo-motorio si ferma ad ogni livello sull'asse z per acquisire l'immagine di ogni piano. La frequenza di campionamento è di 1 s per pila e la risoluzione dei pixel nel piano x-y è 0,2-0,3 m (Figura2A). Una registrazione include normalmente 10 pile di immagini pre-puff e 150 pile di immagini post-puff.</li>
</ol>6. Trattamento dei dati
<ol><li>Elaborare i dati utilizzando software analitico personalizzato. Appiattire ogni pila di immagini in un'immagine in base alla proiezione di intensità massima (Figura 2B). Disegnare una regione di interesse rettangolare (ROI) con una larghezza di 3 m perpendicolarmente attraverso il recipiente di interesse (Figura 2C).</li>
	<li>Per ridurre al minimo l'interferenza dalle ombre dei globuli rossi e dalle vibrazioni minori della corteccia, calcolare la media del ROI rettangolare proiettandolo in una linea, che rappresenta quindi il profilo medio del segmento del vaso. Eseguire questa operazione per ogni immagine di intensità massima.</li>
	<li>Tracciare le linee di profilo come immagine 2D con l'asse x che rappresenta le immagini di massima intensità in ordine cronologico (Figura2D, pannello superiore). Utilizzare un algoritmo di contorno attivo (segmentazione Chan-Vese) per trovare i bordi della nave8,9 (indicata da curve rosse; Figura 2 D, pannello superiore).</li>
	<li>Calcolare il percorso temporale del diametro cambia come la differenza tra i bordi del vaso sanguigno (distanza verticale tra le curve rosse superiore e inferiore in Figura 2D, pannello inferiore). Normalizza modifiche di diametro alla linea di base del diametro pre-puffing e le curve di traccia del diametro cambiano nel tempo. Eseguire questa operazione per ogni ROI (Figura 2E).</li>
	<li>L'ampiezza di risposta del recipiente è definita come l'ampiezza di picco più alta / più bassa dopo lo sbuffamento. La latenza di risposta è definita come la latenza dell'ampiezza half-max (Figura 2G). Tracciare manualmente la struttura vascolare scheletrata posizionando i nodi lungo i vasi (Figura 2F) e misurando la distanza geografica tra ogni ROI e l'arteriosa penetrante. Calcolare la velocità CVR dividendo le distanze per le differenze di latenza.</li>
</ol>7. Iniezione vettoriale virale
<ol><li>Per studiare simultaneamente le risposte astrocitiche al calcio, iniettare un volume di 0,6 -L vettore virale (p-ac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) nella corteccia somatosensoriale dei topi rossi, seguendo la procedura standard di iniezione di vettori virali stereotassici 10.</li>
	<li>Dopo tre settimane, gli astrociti nella corteccia somatosensoriale del topo esprimono l'indicatore del calcio geneticamente codificato, GCaMP6f. Seguire la procedura chirurgica di cui sopra e l'imaging a due fotoni per i topi. Per distinguere tra astrociti e lumina della nave, TRITC-dextran invece di FITC-dextran viene utilizzato per macchiare la lumina del vaso.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease.">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses.">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks.">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo.">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo.">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex.">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li><li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation.">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li><li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images.">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain.">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain.">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).</li><li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2++Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo.">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li><li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons.">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726 (2018).</li><li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+(Scape)+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms.">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una sfida per gli studi vascolari è la misurazione precisa dei diametri dei vasi. Il metodo che qui descriviamo ha usato un obiettivo di piezo motorizzato per creare immagini iperimpilate veloci e ripetitive mediante microscopia a due fotoni. In primo luogo, questo metodo consente ripetuti esami dell'arteriola penetrante, 1st ordine e 2nd ordine capillari senza perdita di messa a fuoco e ha portato alla scoperta di risposte vascolari lentamente condotte nei capillari in vivo. In secondo luogo, in c...

Il cervello ha un alto tasso di consumo di energia. Circa il 20% dell'ossigeno e il 25% del glucosio consumato dal corpo umano sono dedicati alla funzione cerebrale, mentre il cervello occupa solo il 2% della massa corporea totale. Il mantenimento della normale funzione cerebrale richiede un apporto sufficiente ed efficiente di ossigeno e nutrizione da flusso sanguigno in una complessa rete di vasi. L'attività cerebrale locale e il flusso sanguigno cerebrale (CBF) sono robustamente accoppiati, a seconda delle proprietà funzionali di neuroni, astrociti, periciti, cellule muscolari lisce (SMC) e cellule endoteliali (EC)1. Recentemente, i primi ordini di capillari che si ramificano dalle arteriole penetranti sono emersi come un 'hotspot'2, che mostra la regolazione attiva del flusso sanguigno capillare. Una risposta vascolare lenta condotta (CVR) è stata scoperta in questo 'hotspot' nella corteccia somatosensoriale del topo sia durante la stimolazione del baffo che l'espulsione locale (puffing) di ATP con una micro-pipetta di vetro3.
Sebbene l'imaging in vivo mediante microscopia fluorescente a scansione laser a due fotoni sia stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neurovascolari nella corteccia cerebrale, la maggior parte degli studi ha misurato i diametri dei vasi sanguigni e ne ha studiato la regolazione in un piano x-y bidimensionale (2D). Le sfide sono: in primo luogo, i vasi sanguigni cerebrali e la loro adozione di astrociti, periciti e SMC costruiscono rami in tre dimensioni (3D). È quindi fondamentale studiare le loro interazioni in 3D. In secondo luogo, anche una piccola quantità di deriva a fuoco influenzerà la misurazione precisa sia dei diametri dei vasi che dei segnali fluorescenti cellulari. Infine, i CCR sono veloci e di vasta portata in tre dimensioni. La scansione del volume 3D è ottimale per rilevare i CCR e svelare i loro meccanismi. Abbiamo implementato un obiettivo motorio piezoso in un microscopio a due fotoni per studiare la corteccia somatosensoriale dei topi in vivo, consentendo misurazioni precise del diametro mediante proiezioni di intensità massima delle immagini ottenute.
Le micropipe in vetro sono state spesso utilizzate per studi sul cervello in vivo, ad esempio per caricare alla rinfusa coloranti organici4, registrare EEG5 e per il bloccaggio delle patch6. Tuttavia, permangono delle limitazioni. Comunemente, la punta della micro-pipetta di vetro è posizionata in modo incontuoso, o la micro-pipetta non viene utilizzata per interventi locali. Qui, abbiamo ottimizzato la procedura di inserimento di micro-pipette e espulsione locale.
Inoltre, la combinazione di microscopia 3D a due fotoni e indicatori fluorescenti geneticamente codificati offre un'opportunità senza precedenti di studiare l'accoppiamento neurovascolare in un ambito 3D. In questo studio, abbiamo approfittato di questo e iniettato vettori virali che trasportano indicatori di calcio geneticamente codificati specifici dell'astrocite nella corteccia somatosensoriale del topo. Gli astrociti e i diametri dei vasi sono stati immagini simultaneamente combinando diversi marcatori fluorescenti.
Nel complesso, presentiamo un metodo ottimizzato di espulsione locale (puffing) da micro-pipetta di vetro e imaging veloce per iperpilati a due fotoni, che consente una misurazione precisa dei cambiamenti di diametro capillare. Inoltre, il nostro metodo fornisce un nuovo strumento per studiare contemporaneamente i profili 3D delle risposte Ca2 in astrociti e risposte di diametro vascolare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

La manutenzione della normale funzione cerebrale richiede una fornitura sufficiente ed efficiente di ossigeno e nutrizione da parte di una complessa rete di vasi. Tuttavia, la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) è incompletamente compresa, soprattutto a livello capillare. La microscopia a due fotoni è un potente strumento ampiamente utilizzato per studiare la CBF e la sua regolazione. Attualmente, questo campo è limitato dalla mancanza di studi in vivo sulla microscopia a due fotoni che esaminano (1) le risposte CBF in tre dimensioni, (2) hanno condotto risposte vascolari e (3) interventi localizzati all'interno della rete vascolare. Qui, descriviamo un metodo 3D in vivo usando la microscopia a due fotoni per studiare le risposte vascolari condotte provocare l'espulsione locale dell'ATP con una micropipetta di vetro. Il nostro metodo utilizza immagini iperimpilate a due fotone veloci e ripetitive, fornendo misurazioni precise del diametro mediante la proiezione dell'intensità massima delle immagini ottenute. Inoltre, mostriamo che questo metodo può essere utilizzato anche per studiare le risposte di calcio astrocitico 3D. Discutiamo anche dei vantaggi e dei limiti dell'inserimento di micropipe in vetro e dell'imaging iperstack a due fotoni.

Una volta completato l'intervento, i topi sono stati trasportati al microscopio a due fotoni (Figura1A). Una micropipetta di vetro contenente 1 mM ATP è stata inserita in prossimità del vaso sanguigno di destinazione nella posizione di destinazione (Figura 1B).
Abbiamo eseguito l'imaging iperstack dando un soffio di 1 mM ATP (Figura 2A, suppleme...

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In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Vi presentiamo una procedura di espulsione locale ottimizzata utilizzando una micro-pipetta di vetro e un metodo di imaging iperpilato a due fotoni veloce, che consente una misurazione precisa dei cambiamenti di diametro capillare e l'analisi della sua regolazione in tre dimensioni.

In Vivo microscopia bidimensionale bidimensionale per studiare le risposte vascolari mediante l'espulsione locale dell'ATP utilizzando una micropipetta di vetro

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Questo protocollo è progettato per studiare le risposte vascolari condotte lentamente nei capillari cerebrali suscitate dall'espulsione locale dell'ATP. Il vantaggio di questa tecnica è quello di simulare le attività sinaptiche locali mediante espulsione locale di pipette e di mantenere il contenitore scarso a fuoco mediante microscopia a due fotoni 3D. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare il neuroma cerebrale e l'attività gliale a riposo e sulla stimolazione in tre dimensioni. A dimostrare la procedura sarà Michael L

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K Views.  University of Copenhagen. Questo protocollo è progettato per studiare le risposte vascolari condotte lentamente nei capillari cerebrali suscitate dall'espulsione locale dell'ATP. Il vantaggio di questa tecnica è quello di simulare le attività sinaptiche locali mediante espulsione locale di pipette e di mantenere il contenitore scarso a fuoco mediante microscopia a due fotoni 3D. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare il neuroma cerebrale e l'attività gliale a riposo e sulla stimolazione in tre dim...

Video: In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Two-photon Imaging of Microglial Processes&#039; Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...