La vascolarizzazione cerebrale è una complessa rete di arteriose penetranti, capillari e venule ascendenti. Questi vasi sono racchiusi da cellule murali, come i periciti che si ricoprono, che esprimono l'actina della muscolatura liscia alfa, e si trovano all'interno dei primi quattro rami dalle arterie penetranti. Utilizziamo topi transgenici Acta2-RCaMP 1.07, per visualizzare i transienti di calcio in queste cellule, attraverso l'espressione dell'indicatore di calcio geneticamente codificato RCaMP.
Il calcio svolge un ruolo importante nella contrazione di queste cellule e nel controllo del flusso sanguigno. I periciti capillari si trovano più a valle nella rete vascolare e possono essere etichettati in altri modelli transgenici. Tuttavia, ci concentriamo sulla guaine dei periciti in questo metodo.
I nostri topi sono stati impiantati chirurgicamente con una finestra cranica cronica che consente l'accesso alla vascolarizzazione cerebrale per l'imaging. Qui, delineiamo le necessarie fasi di preparazione e l'iniezione della vena della coda seguite dai due metodi di imaging e analisi dei fotoni necessari per acquisire i dati sul calcio dei periciti e le informazioni sul flusso sanguigno negli animali anestetizzati. I seguenti elementi sono necessari per un'iniezione di catetere della vena della coda: siringhe da insulina, un pezzo di tubo PE10 da 15 centimetri, aghi calibro 30, garza, soluzione salina, pinza, colorante destrone alla fluoresceina verde, pinze e forbici.
Abbiamo anche un ago con anestesia ketamina xilazina che inietteremo prima dell'imaging in quanto è migliore dell'isoflurano per le misurazioni del flusso sanguigno. Usando le pinze, rompere un ago calibro 30 dal mozzo. Inserire con attenzione l'ago all'estremità del pezzo di tubo pe10 attaccato a una siringa riempita di soluzione salina.
Questo è il catetere per iniezione. Anestetizzare un mouse con isoflurano e applicare il gel I-Lube. Posizionare un campo di guanti con acqua tiepida sulla coda per dilatare la vena laterale.
Dopo aver pulito la coda con etanolo, inserire l'ago nella vena e iniettare delicatamente soluzione salina attraverso il catetere per assicurarsi che l'ago sia posizionato correttamente. Cambiare la siringa sul catetere per una siringa riempita con colorante destro fluoresceina. Iniettare lentamente il colorante per assicurarsi che non entrino bolle nel tubo.
Sostituire la siringa destrano con la siringa salina e risciacquare il tubo fino a quando non rimane colorante nel tubo. Rimuovere l'ago e premere con una garza. Iniettare ketamina xylazine anestesia per l'imaging.
Con la testa del mouse fissata su una piastra riscaldante, pulire la finestra cranica con applicatori dentali. Applicare il gel ad ultrasuoni sulla finestra e mettere a fuoco attraverso l'obiettivo del microscopio a due fotone. Per l'imaging a due fotoni, utilizziamo un microscopio con laser zaffiro in titanio sintonizzabile per fluorescenti, eccitazione e tubi fotomoltiplicatori per il rilevamento delle emissioni.
Nel software del microscopio, impostare la lunghezza d'onda su 990 nanometri per eccitare sia RCaMP che fluoresceina destrano. Quindi impostare la potenza del laser regolando la tensione della cella pockel e la sensibilità del rilevatore PMT. Scansione dal vivo con questi parametri e risoluzione più elevata, si possono vedere cellule murali positive RCaMP e il plasma sanguigno etichettato fluorescentemente.
Si consiglia l'acquisizione di una pila di profondità per localizzare correttamente i periciti nella rete vascolare. Quando si è focalizzati nella parte superiore del tessuto vicino ai vasi PO, impostarlo come punto zero e parte superiore dello stack della serie Zed, quindi concentrarsi verso il basso nel tessuto alla profondità desiderata e impostarlo come parte inferiore dello stack. La potenza del laser deve essere regolata per aumentare man mano che il microscopio si muove più in profondità attraverso la pila.
Aprendo la serie Zed nel software di elaborazione delle immagini, unire i due canali come immagini colorate e scansionare attraverso la pila per periciti e vasi sanguigni di interesse. Seleziona le regioni di interesse che contengono periciti e salva le posizioni per aiutare a localizzare nuovamente questi punti nelle future sessioni di imaging. Per raccogliere e spostare un evento di calcio pericitario, aumentare il frame rate di acquisizione a più di 10 fotogrammi al secondo.
Impostare la durata dell'imaging su 60 secondi e aggiornare il percorso di salvataggio con un nome di file univoco. Zoom ottico sul vaso per tenere conto della risoluzione inferiore e per ottenere una visione più ravvicinata del pericita. Acquisire la serie T.
Per misurare il diametro dei vasi sanguigni e la velocità dei globuli rossi, selezionare la scansione della linea per avviare una scansione unidimensionale con il microscopio. Impostare innanzitutto la durata della scansione in millisecondi. Quindi disegna una linea che taglia in due la nave di interesse e si muove parallelamente lungo la nave.
Questo genererà un chimografo del diametro del vaso a sinistra e delle striature dei globuli rossi che si muovono attraverso il vaso a destra. Vedere la tabella dei materiali per un elenco completo dei programmi e dei pacchetti utilizzati in questo protocollo. Per prima cosa seleziona le regioni di interesse a mano nel software di elaborazione delle immagini.
Carica il file della serie T, prendi la media dello stack e crea un'immagine colorata. Selezionare lo strumento poligono e delineare le strutture dei periciti che rimessano il rivestimento visibile come il soma e i processi. Assegna a ciascuna regione di interesse un nome univoco e salvali come una cartella zip che può essere caricata in seguito nel software di programmazione.
Aprire il software di programmazione e assicurarsi che le cartelle per i pacchetti di elaborazione delle immagini siano sul percorso. Importare la serie T di calcio nel software di programmazione e definire cosa c'è su ciascun canale. In questo caso, si tratta di un segnale cellulare sul canale uno e del plasma sanguigno sul canale due.
Traccia i dati come un film all'interno del software di programmazione per facilitare la visualizzazione. Per rimuovere le fluorescenti verdi dal destrano della fluoresceina che sanguina nel canale RCaMP rosso, deselezionare i canali nel pacchetto di elaborazione delle immagini. Per prima cosa seleziona una regione che contiene solo fluoroforo 1, RCaMP in questo caso.
In secondo luogo selezionare una regione che contiene solo fluoroforo 2, fluoresceina nel plasma. Infine selezionare un'area di sfondo che non abbia né fluoroforo. Questo genera una matrice di contributo spettrale, che viene applicata a ciascun pixel in ciascun canale.
Migliora significativamente la localizzazione del segnale RCaMP, che migliorerà il rilevamento di eventi di calcio in queste strutture. Esistono diversi modi in cui i dati di imaging del calcio possono essere analizzati all'interno dei pacchetti di elaborazione delle immagini. Per prima cosa esegui l'analisi di segnalazione cellulare sul film di calcio non mixato e carica le regioni di interesse dalla cartella zip che sono state selezionate dai periciti a mano in precedenza.
Impostare il fattore di scala su uno perché non è necessario ridimensionare le regioni. Dopo l'elaborazione, generare trame di ogni ROY e le tracce di calcio normalizzate in diversi colori. Se il codice non rileva la maggior parte degli eventi di calcio nelle singole tracce, modificare i parametri incorporati all'interno della casella di ottimizzazione, ad esempio diminuendo la soglia per i dati filtrati a passaggio breve a tre volte la deviazione standard del periodo di base, ovvero i primi 30 fotogrammi della serie T.
Al fine di rilevare e classificare i segnali, la traccia di calcio normalizzata viene filtrata a lungo passaggio e passaggio di banda, il che aiuta a levigare i dati per ampiezza e con stime, ma anche a determinare se i segnali sono picchi singoli, multi picchi o plateau. Output dei dati come file CSV per ulteriori analisi statistiche. Esegui l'analisi della segnalazione cellulare una seconda volta sul film di calcio non mixato e seleziona l'identificazione automatica della regione di interesse in base all'attività e al cambiamento delle fluorescenti in tre dimensioni, X, Y e tempo.
Traccia i risultati del processo per visualizzare le regioni di interesse identificate è di colori diversi. Se l'algoritmo non rileva i ROY che sono chiaramente visibili a occhio nel filmato, modificare i parametri incorporati, ad esempio aumentando il filtro gaussiano che attenua i dati nel tempo e diminuendo la soglia per trovare i ROY a tre volte la deviazione standard della linea di base. Traccia i ROY come un film per un'ulteriore visualizzazione.
Output dei dati come file CSV per ulteriori analisi statistiche. Importare il file di dati kymograph di scansione della linea nel software di programmazione e definire cosa c'è su ciascun canale. Eseguire la funzione di analisi del diametro sulla scansione della linea, che apre una casella per selezionare l'area corrispondente al diametro nel kymograph.
Disegna una scatola al di fuori dei confini fluorescenti del kymografo, che corrisponda al diametro del recipiente. Elaborare questa classe di dati per misurare l'intera larghezza a mezzo massimo per il diametro della nave e generare un grafico. Quindi eseguire il tasso di velocità sull'analisi di trasformazione e disegnare una casella all'interno del bordo delle fluorescenti del kymograph.
Elaborare questa classe di dati per calcolare la velocità, il flusso e la densità lineare dei globuli rossi. Output dei risultati del flusso sanguigno come file CSV per ulteriori analisi. La selezione manuale delle strutture cellulari consente di rilevare le fluttuazioni di calcio all'interno di queste regioni, compresi diversi tipi di picchi di segnale, come picchi singoli e multi picchi, dopo che le tracce di calcio normalizzate sono state filtrate passa-basso e passa banda.
Inoltre, le regioni di interesse vengono identificate raggruppando i pixel attivi in cui l'intensità delle fluorescenti cambia nel tempo utilizzando algoritmi di elaborazione delle immagini. Questo può essere applicato a qualsiasi segnale cellulare dinamico regolando il tempo, la soglia e i parametri spaziali per comprendere la dimensione e la forma previste del segnale. Diminuendo la soglia per l'identificazione del segnale si trovano più regioni di interesse.
I chimografi emodinamici chiari vengono analizzati per misurare il diametro e la velocità dei globuli rossi nei vasi sanguigni vicino ai periciti che si riscaldano. Il diametro è calcolato dall'intera larghezza a metà massimo delle fluorescenti. La velocità dei globuli rossi è approssimata dalle strisce fatte da globuli rossi non etichettati, dove l'angolo viene immesso in una trasformazione del radon per calcolare la velocità.
I kymografi di scarsa qualità, dove c'è saturazione fluorescente, scarso rapporto segnale/rumore o movimento del campo di imaging, creano grafici inaffidabili con punti di errore, indicati come croci rosse, dove i dati non possono essere determinati. La qualità dei dati acquisiti è fondamentale per un buon esito e seguire i passaggi descritti in questo protocollo garantisce buoni risultati. In questo video, delineiamo la procedura per l'imaging combinato del calcio dei periciti che infendono il cervello e le misurazioni del flusso sanguigno mediante due microscopia fotonica.
Queste tecniche sono utili per affrontare domande sulla fisiologia delle cellule murali e sulla localizzazione all'interno della rete vascolare cerebrale, ma possono essere adattate per studiare i transitori del calcio in qualsiasi tipo di cellula nel cervello o in altri sistemi di organi.
