La microscopia DIC è superiore al campo scuro nelle nanoparticelle plasmoniche di imaging in ambienti complessi. Tuttavia, il DIC richiede anche maggiori conoscenze e abilità per ottenere risultati riproducibili. La microscopia DIC fornisce sia un'alta risoluzione laterale che una profondità di campo superficiale.
Entrambi questi tratti sono estremamente importanti quando si monitorano le nanoparticelle all'interno delle cellule o in ambienti complessi. Per iniziare, utilizzare una penna scribing per posizionare un gratta e vinci poco profondo e corto al centro di ogni coverlip di vetro, quindi pulire il vetro come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Successivamente, utilizzare una micropipetta per rimuovere 100 microlitri di una soluzione di nanoparticelle d'oro da 05 milligrammi per millilitro dal suo contenitore di stoccaggio originale ed espellere la soluzione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare il campione per 10 minuti a 6.000 volte la gravità. Al termine, rimuovere il supernatante con una micropipetta per sbarazzarsi del tensioattivo in eccesso dalla soluzione di nanoparticelle. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di acqua ultrapura al tubo di centrifuga.
Vortice brevemente il campione per rompere il pellet, quindi sonicarlo per 20 minuti immediatamente dopo per rimpiorsi completamente gli aggregati di nanoparticelle. Utilizzando una micropipetta, dropcast sei microlitri di soluzione di nanoparticelle sul coperchio di vetro pulito e graffiato. Quindi capovolgere con cura il coverslip e posizionarlo sopra un secondo pezzo di vetro al microscopio più grande.
La goccia dovrebbe diffondersi rapidamente uniformemente tra i due pezzi di vetro. Fai attenzione a evitare di intrappolare bolle d'aria tra i due pezzi di vetro. Utilizzare una linea stretta di smalto per sigillare i bordi della coverlip per evitare l'evaporazione del liquido.
Posizionare il campione sullo stadio del microscopio e allineare l'obiettivo e il condensatore del microscopio. Regolare lo stato attivo per trovare il piano focale con il campione su di esso e individuare il gratta e vinci creato in precedenza. Concentrati su di esso e ottimizza l'attenzione fino a quando le nanoparticelle non entrano in vista.
Per determinare il posizionamento accurato del condensatore, utilizzare il metodo di illuminazione Kohler iniziando con l'obiettivo 20x e quindi passando ad alti ingrandimenti come 80 o 100x. Selezionare quindi un'area di interesse all'interno del campione per l'imaging. Centrare l'area nel campo visivo della fotocamera e regolare la messa a fuoco in base alle esigenze.
Se il microscopio ha il design de Senarmont, inizia con il polarizzatore vicino alla massima estinzione dello sfondo e ruota gradualmente il polarizzatore verso la diminuzione dell'estinzione dello sfondo. L'intensità dello sfondo aumenterà gradualmente. L'impostazione ideale si ottiene quando le nanoparticelle raggiungono la loro maggiore differenza di intensità rispetto alla media di fondo locale.
Per le nanoparticelle plasmoniche, il contrasto maggiore è tipicamente raggiunto con uno sfondo relativamente scuro all'estinzione massima dello sfondo o vicino alla massima. Spegnere l'illuminazione della stanza per evitare che l'illuminazione vagante interagisca con il processo. Mettere in atto un 10 nanometro a larghezza intera a mezzo filtro passa-banda massimo con la sua lunghezza d'onda centrale co-localizzata con la principale lunghezza d'onda localizzata di risonanza plasmonica di superficie al fine di visualizzare la regione di interesse.
Quindi, regolare l'intensità della lampada o il tempo di esposizione fino a quando il livello di sfondo non è dal 5% al 40% del livello massimo di capacità della fotocamera. Nessun oggetto all'interno della regione di interesse deve mostrare intensità di segnale che superano il 90% del livello massimo di intensità della fotocamera. Immagini il campione con una serie di filtri passa banda che hanno ciascuno una larghezza intera a mezzo massimo di 10 nanometri e che nel loro complesso consentono l'imaging su tutta la gamma di lunghezze d'onda di interesse.
Assicurarsi che l'intensità di sfondo nelle immagini rimanga entro il 5% l'una dall'altra regolando il tempo di esposizione e non la potenza della lampada. Dopo aver cambiato filtro, rifocalizzare l'esempio prima di acquisire immagini. Salvare le immagini come file TIFF non compressi e/o nel formato di file nativo del software al fine di conservare tutte le informazioni pertinenti.
Per iniziare l'analisi, aprite l'immagine con ImageJ. Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare un rettangolo intorno all'area principale di interesse. Quindi sulla barra degli strumenti selezionare l'immagine, andare in zoom e selezionare la selezione.
La finestra di imaging ingrandirà l'area selezionata. Selezionare quindi l'immagine, andare a regolare e selezionare luminosità/contrasto. Per migliorare la visualizzazione dell'area campione, regola il minimo, il massimo, la luminosità e il contrasto dell'immagine.
Questi adeguamenti non alterano i dati scientifici, ma consentono semplicemente una migliore visibilità della regione campione. Ora, usate di nuovo lo strumento rettangolo e disegnate una scatola attorno alla prima nanoparticella da misurare. La scatola dovrebbe essere solo leggermente più grande del disco arioso della nanoparticella.
Una volta selezionata, vai ad analizzare e seleziona misura. Viene visualizzata una nuova finestra che segnala le intensità minime, massime e media per i pixel che si trovano all'interno della casella selezionata. Mantenendo le dimensioni originali della scatola, trascinare la scatola in un'area immediatamente adiacente alla particella in cui il contrasto di fondo è relativamente uniforme e non sono presenti particelle o contaminanti.
Utilizzare nuovamente lo strumento misura per determinare l'intensità media per l'area di sfondo. Ripetere questo processo per ogni particella in tutte le immagini della serie. Quindi esportare i dati in un foglio di calcolo per calcolare il contrasto o l'intensità di ogni particella su tutte le lunghezze d'onda e gli angoli.
Immettere l'equazione seguente per calcolare il contrasto di ogni particella. Infine, tracciare il profilo spettrale in una data posizione di nanoparticella tracciando i dati con la lunghezza d'onda lungo l'asse X e il contrasto o l'intensità lungo l'asse Y. Per determinare l'impostazione di imaging ottimale, queste nanosfere d'oro sono state immagini in diverse impostazioni del polarizzatore.
A zero gradi, le particelle appaiono per lo più bianche con una striscia scura che attraversa la loro sezione centrale. Questo è indicativo della polarizzazione incrociata per i campioni di nanosfera. Quando il polarizzatore viene ruotato in angoli diversi, le particelle proiettano ombre scure verso un angolo.
Tuttavia, i valori di contrasto delle particelle cambiano radicalmente. Per questo campione, l'impostazione di imaging ottimale è con uno spostamento del polarizzatore di 10 gradi. Qui la lunghezza d'onda è tracciata contro il contrasto delle nanosfere d'oro.
Ogni punto dati rappresenta una media di 20 nanosfere per ogni diametro delle particelle. Il contrasto di picco per ogni particella si sposta leggermente a seconda delle sue dimensioni. L'intensità e la rotazione sono ancora più importanti con forme anisotropiche come questa nanorod d'oro.
Qui la lunghezza d'onda viene tracciata contro l'intensità in due diverse impostazioni del polarizzatore. In ogni caso, l'intensità del lato positivo è molto più forte di quella del lato oscuro. Il profilo di intensità di una singola nanorod d'oro alla sua lunghezza d'onda localizzata di risonanza plasmonica superficiale durante la rotazione dello stadio mostra una grande differenza di intensità tra i lati scuro e luminoso mentre il campione viene ruotato di 180 gradi.
L'imaging dei campioni è estremamente importante. Richiede diligenza e pazienza da parte del microscopista. Se si esegue un esperimento che richiede la rivalutazione del campione per una serie di giorni, punti di riferimento come i gratta e vinci sono fondamentali per trasferire l'area di interesse.
La microscopia DIC sta crescendo nell'interesse dei ricercatori che studiano le nanoparticelle, specialmente in ambienti dinamici e cellulari. Perché DIC offre una risoluzione spaziale ottimale, specialmente in ambienti di campionamento complessi.
