HPV RNA CISH consente il rilevamento di un'infezione attiva del papilloma virus umano. Poiché l'ibridazione in situ prende di mira l'RNA HPV, questa tecnica consente la visualizzazione di una trascrizione attiva del virus. Ha una risoluzione spaziale precisa e buone prestazioni diagnostiche.
Il rilevamento dell'HPV può supportare la diagnosi di diverse lesioni correlate all'HPV, come il carcinoma a cellule squamose orofaringee o la neoplasia cervicale. Può anche avere un'influenza sulla prognosi. Dopo aver preparato tamponi e reagenti contro-colorazione, preparare un reagente di recupero del bersaglio x in un grande becher aggiungendo 70 millilitri di reagente di recupero bersaglio 10x a 630 millilitri di acqua distillata.
Posizionare il becher su una piastra riscaldante con agitatore magnetico e coprirlo con un foglio di alluminio. Far bollire il suo contenuto a 100 gradi Celsius per 10-15 minuti assicurandosi di non bollirlo per più di 30 minuti. Per bloccare l'attività della perossidasi su diapositive con sezioni tissutali precedentemente deparaffinizzate e posizionate nel rack scorrevole, aggiungere da quattro a sei gocce, quanto basta per coprire il campione, di perossido di idrogeno ad ogni diapositiva e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente.
Lavare gli scivoli due volte per due minuti in acqua distillata a temperatura ambiente. Per rompere i limiti del tessuto dell'RNA nelle sezioni del tessuto dell'RNA, rimuovere prima il foglio di alluminio da quello bollente x TRR usando un artiglio e smettere di mescolare. Immergere il porta scorrevole lentamente e con molta attenzione.
Coprire di nuovo il becher con il foglio di alluminio e incubare per 15 minuti. Utilizzare l'artiglio per trasferire immediatamente il portapacchi caldo in un bagno d'acqua distillato e lavarlo per due minuti. Lavare i vetrini quindi in etanolo fresco al 100% per due minuti e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per due minuti.
Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare una barriera intorno a ciascun campione e lasciarla asciugare per almeno cinque minuti. Per la digestione proteasi, posizionare le diapositive nel vassoio controllato dall'umidità e aggiungere circa quattro gocce di Protease Plus per campione. Coprire il vassoio con un coperchio e inserirlo nel forno di ibridazione per 30 minuti a 40 gradi Celsius.
Rimuovere il vassoio dal forno e rimuovere il portascivole. Lavorare una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare lo scivolo nel rack dello scivolo immerso in un piatto di colorazione riempito con acqua distillata. Lavare gli scivoli due volte per due minuti in acqua distillata a temperatura ambiente con agitazione costante.
Per avviare l'ibridazione, toccare e scorrere le diapositive per rimuovere il liquido in eccesso e posizionarle di nuovo nel rack scorrevole. Rimuovere la sonda HPV preriscaldata dal forno e aggiungere circa quattro gocce per coprire interamente ogni sezione. Coprire il vassoio con il coperchio e inserirlo nel forno per due ore a 40 gradi Celsius.
Dopo aver completato l'incubazione, rimuovere il vassoio dal forno e rimuovere la griglia. Una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare lo scivolo nel rack di scorrimento immerso in un piatto di colorazione riempito con un tampone di lavaggio x, lavare le diapositive per due minuti a temperatura ambiente con agitazione costante e ripetere con un tampone di lavaggio fresco di una x. Toccare e scorrere per rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive e posizionarlo nuovamente nel rack scorrevole.
Aggiungere circa quattro gocce di AMP1 a temperatura ambiente per sezione per coprire interamente ogni sezione. Coprire il vassoio con il coperchio e inserirlo nel forno per 30 minuti a 40 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il vassoio dal forno, rimuovere la griglia.
Lavorare una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare lo scivolo nel rack di scorrimento immerso in una piastra di colorazione riempita con un tampone di lavaggio x, lavarsi per due minuti a temperatura ambiente con agitazione costante e ripetere con un tampone di lavaggio fresco di una x. Erogare lo stesso numero di gocce di ogni soluzione DAB-A e DAB-B in un tubo di dimensioni appropriato per realizzare circa 120 microlitri di substrato DAB per sezione e vortice. Prendere ogni diapositiva, una alla volta, dal rack scorrevole, toccare e scorrere per rimuovere il liquido in eccesso e posizionarlo di nuovo nel rack scorrevole.
Pipetta circa 120 microlitri di miscela DAB su ogni sezione tissutale, assicurandosi che le sezioni siano coperte. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere con la controsottenzione. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio per la lamelle di vetro, quindi posizionare le doghe sugli scivoli e lasciarle asciugare all'aria.
Dopo alcune ore, procedere con la valutazione utilizzando un microscopio ottico come descritto nel manoscritto. Come descritto qui nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, la presenza di colorazione punctiforme marrone nel citoplasma o nei nuclei delle cellule tumorali ha definito un caso positivo. I risultati sono stati divisi in due punteggi, RNA CISH punteggio alto e basso come osservato con un obiettivo 20x.
La colorazione del punteggio CISH dell'RNA è considerata bassa se osservata in meno del 50% delle cellule tumorali e copre meno dell'80% della superficie cellulare. D'altra parte, il punteggio CISH dell'RNA è alto se osservato in oltre il 50% delle cellule tumorali macchiate o con la superficie di colorazione superiore all'80% in oltre il 30% delle cellule tumorali. Non si dovrebbe mai lasciare asciugare le diapositive per l'ibridazione.
Non dimenticare di preriscaldare la sonda. Per ogni campione, eseguire un controllo positivo e negativo al fine di valutare la qualità dell'RNA.
