Questo metodo potrebbe aiutarci a rispondere a domande chiave relative all'espressione genica che ci mostrano esattamente come la struttura della cromatina influisce sull'espressione genica e su come l'organizzazione della cromatina regola la dinamica trascrizionale. Abbiamo sviluppato questa tecnologia perché volevamo essere in grado di alterare controllabilmente l'architettura cromosomica per consentire la creazione di loop di cromatina a lungo raggio. Mentre allo stesso tempo hanno la capacità di invertire il contesto cromatico per ripristinare la struttura cromosomica endogena.
Questo metodo è stato progettato per la facilità d'uso e l'ampia applicabilità. Abbiamo approfittato di un dimerizzatore atossico e di specie ortogonali di dcas9 per consentire un uso più ampio del sistema. Abbiamo sviluppato questo metodo perché volevamo essere in grado di rispondere alla domanda di lunga data su se l'espressione genica genera architettura cromosomica o se la struttura cromosomica porta a cambiamenti nell'espressione genica.
La progettazione delle sequenze di RNA crispr-guide e il mantenimento delle colture cellulari sono descritti nel protocollo di testo. Le mappe plasmidiche e i primer utilizzati sono elencati lì. Iniziare la preparazione plasmide mescolando cinque microgrammi del plasmide CRISPR lentivirale con tre microlitri di BsmB1 tre microlitri di fosfatasi alcalina sei microlitri di tampone di digestione 10x e 0,6 microlitri di 100 millimolare di DTT appena preparato.
Portare il volume totale a 60 microlitri di acqua distillata doppia e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti per digerire e de-fosforilato il plasmide. Quindi, gel purificare il plasmide digerito nel plasmide ad anello e nell'acqua distillata doppia. Successivamente, preparare le reazioni di ricottura per le coppie di RNA guida.
Combinare un microlitro di ogni RNA guida a 100 micromolari con un microlitro di tampone di legatura T4 10x 6,5 microlitri di acqua distillata doppia e 0,5 microlitri di T4 PNK per un volume di reazione totale di 10 microlitri. Per ricottura le coppie di RNA guida alle loro sequenze bersaglio incubare le miscele a 37 gradi celsius a 30 minuti seguito da un'incubazione a 95 gradi celsius per 5 minuti, quindi ridurre gradualmente la temperatura a 25 gradi Celsius diminuendola di cinque gradi Celsius al minuto. Successivamente, diluire gli RNA guida ricotta a uno o duecento in acqua distillata doppia.
Ora, preparate le due reazioni di legazione. Mescolare un microlitro del plasmide digerito con 0,5 microlitri di una guida perivaneale diluita RNAse 2,5 microlitri di tampone di legatura 2x un microlitro di acqua distillata doppia e 0,5 microlitri di ligasi. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti per ligare le guide BsmB1 plasmide digerito.
Quindi trasformare il plasmide appena legato in tre batteri stabili e amplificare i batteri utilizzando qualsiasi metodo di preparazione del plasmide. Su un piatto di sei porri, per pozzo, seme 750.000 2n3 Tcells in DMEM con 10%FBS e 1% pen strep. Utilizzare un pozzo per ogni costrutto e incubare le cellule per 24 ore.
Il giorno dopo, cambia l'antibiotico medio-fresco free-DMEM con 10%FBS. Subito dopo aver cambiato il mezzo per ogni pozzo di cellule placcate preparare un tubo di miscela di produzione di Lentivirus. Per ogni reazione, diluire 11 microlitri di reagente di trasfezione lipidico-base con 150 microlitri del mezzo Opti-MEM per ogni reazione.
Quindi in tubi separati preparare il DNA. Unire due microgrammi del plasmide vettoriale lentivirale CLOud9 con due microgrammi degli altri componenti di imballaggio lentivirale. Diluire questa miscela in 150 microlitri del mezzo Opti-MEM.
Quindi combinare volumi uguali della miscela plasmide lentivirale diluita nel reagente di trasfezione diluito a base lipidica e incubare le miscele per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi ad ogni pozzo di cellule aggiungere un tubo delle miscele preparate e continuare l'incubazione. 48 ore dopo, trasferire i mezzi di produzione virali dai pozzi della piastra in conici e farli girare verso il basso a 300 g per cinque minuti.
Quindi trasferire il supernatante in tubi freschi per scartare i detriti pelletati. Ora, usa immediatamente il supporto di produzione virale per trasdurre le cellule bersaglio o congelarlo a 80 gradi Celsius per un uso futuro. Inizia aggiungendo 250 microlitri di ogni costrutto virale di interesse, che in questo caso è composto da plasmidi CLOud9 complementari a un tubo conico da 50 millilitri contenente 80.000 cellule.
Quindi aggiungere abbastanza Polibrene in modo che sia compreso tra uno e otto microgrammi per millilitro in soluzione. Quindi regolare il volume totale in ogni tubo su un millilitro utilizzando mezzi senza antibiotici. Ora per aumentare il contatto tra le particelle virali e le cellule girare le cellule a 800 g per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi sospendere di nuovo le celle al supernatante pipettando. Quindi, caricare la sospensione delle cellule sulle piastre di coltura e incubarle per 24 ore. Il giorno seguente, raccogliere le cellule.
Centrifugarli a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente e sospenderli di nuovo in mezzo normale. Il giorno dopo, aggiungere puromicina e igromicina al mezzo per selezionare le cellule doppiamente trasdutte. L'appropriata concentrazione di antibiotico deve essere determinata in anticipo per ciascun tipo di cellula.
Quindi, incubare le cellule nel supporto di selezione per almeno tre giorni prima di procedere con le applicazioni a valle e continuare a mantenere le cellule e i mezzi di selezione. Per dimerizzare le cellule selezionate e trasdutte CLOud9 aggiungere un ABA millimolare al piatto di coltura. Per i controlli, aggiungere DMSO, quindi mantenere le celle con ABA o DMSO per tutta la durata dell'esperimento.
Per invertire la dimerizzazione, lavare le celle con abbastanza PBS per coprire la superficie della piastra due volte. Successivamente, le cellule di coltura nei supporti senza ABA per mantenerle in uno stato non dimerizzato. L'uso appropriato del sistema CLOud9 induce un contatto reversibile dei costrutti complementari CSA e CSP CLOud9 attraverso l'aggiunta o la rimozione dell'ABA ai mezzi di coltura cellulare.
I costrutti CSA e CSP sono localizzati in regioni genomiche appropriate utilizzando la guida CRISPR standard RNAse. L'immunoprecipitazione della cromatina seguita dalla PCR quantitativa è stata utilizzata per garantire l'accurata localizzazione nel targeting di ogni componente CLOud9. Inoltre la coimmunoprecipazione con e senza dimerizzazione CSA e CSP verificata dall'ABA in presenza del ligando e la reversibilità in assenza del ligando.
Dopo la dimerizzazione dell'ABA, un maggiore contatto tra la beta-globina e l'LCR è stato misurato dalla cattura di conferma cromosomica. Tuttavia, ciò non è stato osservato nei controlli contenenti solo il CSA o solo il costrutto CSP. La creazione dell'interazione beta-globina LCR non eliminò completamente il contatto endogeno di globina LCR.
È stato aggiunto solo al contatto originale. L'aumento dei contatti LCR beta-globina è stato osservato attraverso 72 ore di dimerizzazione indipendentemente dalla regione esatta all'interno della LCR mirata o della regione promotrice beta-globina. Infine, la reversibilità del sistema è stata confermata con la cattura di conferma cromosomica dopo aver rimosso l'ABA.
Ciò ha portato al completo rinnovo della conferma endogena. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di cambiare i supporti e aggiungere nuove celle trasdutte CLOud9 dimerizzate ogni giorno. Non dimenticare che lavorare con il lentivirus può essere estremamente pericoloso e tutte le precauzioni utilizzate in BSL 2 devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
