Il nostro protocollo per un saggio di luciferasi trascritto in vitro a base di RNA aiuta a studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate dal virus del vaiolo. Inoltre, una lunghezza personalizzata del litro Poly(A) consente di studiarne gli effetti normativi sulla traduzione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio della regolazione della traduzione da parte di elementi Cis come 5'UTR e 3'UTR in mRNA e un ampio spettro di iniziazione alla traduzione.
Il saggio del reporter luciferasi trascritto in vitro a base di RNA può essere adattato per incorporare modifiche al tappo e altre modifiche e utilizzato per testare l'effetto sulla traduzione. Per iniziare, progettare primer avanti e indietro per generare l'amplicon PCR contenente i seguenti elementi in direzione da 5'a 3:T7-Promoter, Poly(A)litro, Firefly Luciferase ORF in una coda Poly(A)denominata T7_12A-Fluc, includono diversi nucleotidi extra nel primer in avanti seguiti da T7-Promoter Poly(A)litro o sequenza 5'UTR desiderata e circa 20 nucleotidi corrispondenti alla fine 5 dell'ORF del gene reporter. Regolare la lunghezza del primer in base alla temperatura di fusione corrispondente all'estremità 5 dell'ORF del gene reporter assicurando che la regione corrispondente nel primer sia identica al filamento di senso del gene.
Quindi progettare primer inverso per includere la coda Poly(A) e circa 20 nucleotidi. Regolare in base alla temperatura di fusione corrispondente al 3'end dell'ORF del gene reporter assicurando che la regione corrispondente del primer sia identica al filamento di antisense del gene e che un codone di arresto in-frame sia presente prima della coda Poly(A).. Per il controllo interno, progettare un altro insieme di primer contenenti i seguenti elementi in direzione da 5'a 3:T7-Promoter, una sequenza casuale di codifica 5'UTR contenente la sequenza Kozak, renilla luciferasi ORF e coda Poly(A),denominata T7_Kozak-Rluc.
Per impostare la reazione, aggiungere reagenti nel seguente ordine a un tubo PCR:Acqua libera DNasi, DNA polimerasi ad alta fedeltà 2X, primer e DNA modello luciferasi confermato sequenza. Dopo un ciclo PCR standard in tre tempi per generare un modello di DNA, rilevare il prodotto PCR eseguendo il 5-10% della reazione PCR in un'elettroforesi del gel TAE 1%agarose insieme a uno standard di peso molecolare. Per determinare le dimensioni del prodotto PCR, visualizzare il gel sotto un illuminatore UV.
Dopo aver determinato la corretta dimensione del prodotto PCR, purificarlo utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio utilizzando 100 microlitri di acqua priva di nucleasi per elusare il DNA. Controllare la concentrazione del DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per utilizzarlo immediatamente per la trascrizione in vitro. Per sintetizzare l'RNA dal prodotto PCR, aggiungere i seguenti reagenti a un tubo di microcentrifugo:Acqua libera DNasi-RNasi, miscela tampone NTP, analogico del tappo, modello di prodotto PCR e mix di polimerasi T7-RNA dal kit di trascrizione in vitro.
Mescolare accuratamente. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore e quindi procedere alla purificazione dell'RNA sintetizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA. Per controllare l'RNA purificato, riscaldare l'RNA a 70 gradi per cinque minuti per rimuovere la struttura secondaria ed eseguito su gel TBE di 1,5 agarosio.
Quindi visualizzare il gel sotto un illuminatore UV. Controllare la concentrazione dell'RNA purificato utilizzando uno spettrofotometro. Aliquota e conservare a meno 80 gradi Celsius.
Semina le cellule HeLa in una piastra di 24 potte per ottenere l'80-90% di confluenza il giorno seguente e incubare durante la notte in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Infettare le cellule HeLa con il virus Vaccinia a una molteplicità di infezione di cinque e mantenere le cellule HeLa non infette per il confronto. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 10-12 ore.
Dopo le ore desiderate dopo l'infezione, mescolare 480 nanogrammi di sequenza 12A con mRNA Firefly Luciferase e 20 nanogrammi di sequenza Kozak con mRNA Renilla Luciferase in un tubo di microcentrifugo. In un altro tubo di microcentrifugo aggiungere 1,1 microlitri di reagente di trasfezione lipidica cationica. Aggiungere 55 microlitri di mezzi sieri ridotti a entrambi i tubi, mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi aggiungere 55 microlitri reagente di trasfezione lipidica cationica contenente mezzi sieri ridotti al tubo contenente mRNA. Mescolare delicatamente ma accuratamente con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Durante l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalle cellule e aggiungere 400 microlitri di mezzo siero ridotto per pozzo.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri della miscela cadere saggiamente e uniformemente per pozzo della piastra del pozzo 24. Cinque ore dopo la co-trasfezione con 12A Fluc e Kozak Rluc mRNA, rimuovere il mezzo siero ridotto dalle cellule e lesinare le cellule aggiungendo 150 microlitri 1X lysis buffer dal kit di dosaggio Luciferasi in grado di eseguire due test reporter. Dopo aver incubato per 10 minuti a temperatura ambiente, raschiare le cellule usando gomma e siringa sterile e trasferirli in un tubo di microcentrifugo.
Per pellettare i detriti cellulari, centrifugare il lysate a 12.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 30 microlitri di supernatante per pozzo di una piastra di dosaggio bianca da 96 pareti opache con fondo solido. Utilizzare il kit di saggi Luciferasi e un luminometro a lettore di lastre multimo mode per misurare la doppia luminescenza usando la funzione cinetica come descritto nel manoscritto.
Dopo aver esportato i dati di lettura della luminescenza in un formato di file desiderabile, determinare la velocità di traslazione relativa da 12A Fluc mRNA in celle HeLA non infette e infettate da VACV dividendo il valore Fluc per il valore Rluc di controllo interno. Questo saggio è stato utilizzato per testare l'efficienza di traslazione di un mRNA Fluc che contiene un litro 5'Poly(A)in cellule non infette e infettate da VACV. Sia le cellule non infette che le cellule infette da VACV sono state co-trasfette con successo con l'mRNA Fluc e Rluc.
Dividendo Fluc per Rluc normalizzato l'efficienza di trasfezione nella stabilità dell'RNA nelle cellule. 5'Poly(A)litro contenente mRNA ha un vantaggio traslatore durante l'infezione da VACV rispetto alle cellule non infette. Ciò non era dovuto all'efficienza differenziale della trasfezione o alla stabilità dell'mRNA in quanto il livello di RNA era simile nelle cellule infette da VACV cinque ore dopo la trasfezione dell'mRNA.
Prestare particolare attenzione quando si progettano primer in quanto ciò può influire non solo sull'efficienza di reazione pcr, ma anche su tutti i processi a valle che richiedono il DNA amplificato. Questo metodo è un saggio importante per testare rapidamente la regolazione della traduzione da parte degli elementi Cis. Se possibile, questo metodo dovrebbe essere confermato da altri esperimenti complementari.
Durante l'uso del virus Vaccinia devono essere prese precauzioni ed evitare l'esposizione a sostanze chimiche come il bromuro di etidio e il fenolo.
