I ricercatori hanno precedentemente generato virus influenzali ricombinanti che esprimono reporter di proteine fluorescenti o bioluminescenti. Parte della nostra unica espressione di geni reporter nel virus influenzale limita gravemente il suo uso negli esperimenti. Il nostro protocollo descrive l'uso del virus dell'influenza bireporter che esprime geni reporter fluoresenti e bioluminescenti, e quindi supera la sua limitazione.
Il principale vantaggio di questa tecnica è l'uso di un singolo virus influenzale ricombinante per studi in vitro e in vivo. Quando si esegue questa tecnica, è importante una rapida iniezione del substrato di luciferasi e una corretta pianificazione della manipolazione dei topi, perché il substrato viene rapidamente metabolizzato. Inoltre, si consiglia la rasatura dei topi per migliorare il rilevamento del segnale bioluminescente.
Per infettare i topi, iniziare preparando il BIRFLU in 1X PBS. Mantenere il virus sul ghiaccio fino all'inoculazione. Verificare l'assenza del riflesso di avvicinamento delle dita dei piedi per assicurarsi che il mouse sia anestetizzato e inocularlo per via intranasale con la diluizione BIRFLU preparata.
Assicurati che tutti i topi respirino correttamente prima di riportarli nelle loro gabbie. Aprire il software di imaging e premere Initialize, quindi impostare i parametri che verranno utilizzati per l'imaging. Per monitorare i topi infetti da BIRFLU, radersi il petto per migliorare il rilevamento del segnale bioluminescente.
Una volta che i topi sono anestetizzati, utilizzare un ago calibro 22 per somministrare retrò orbitalmente 100 microlitri di substrato di Nluc luciferasi, diluito uno a 10 in PBS. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare gli animali nella camera di isolamento con il petto rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare la camera di isolamento nello strumento di imaging, chiudere la porta e acquisire immagini.
Dopo l'imaging, riportare i topi nelle loro gabbie e monitorarli fino a quando non si sono completamente ripresi. Utilizzare lo strumento di ROI del software di imaging per analizzare i dati di bioluminescenza acquisiti designando una regione di interesse e facendo clic su misura. Per eseguire l'imaging ex vivo dei polmoni del topo, raccogliere i polmoni in base alle direzioni del manoscritto, avviare il software di acquisizione delle immagini e impostare i parametri per l'imaging.
Una volta inizializzata la macchina, posizionare i polmoni in un vassoio di sfondo nero e assicurarsi che i tessuti siano separati l'uno dall'altro. Introdurre il vassoio nell'imager, chiudere la porta e acquisire immagini. Dopo l'imaging, rimuovere immediatamente i tessuti e conservarli sul ghiaccio a quattro gradi Celsius se i campioni verranno elaborati lo stesso giorno.
Se verranno elaborati in seguito, congelarli rapidamente in un tubo su ghiaccio secco e conservarli a 80 gradi Celsius. Per elaborare le immagini, selezionare lo strumento ROI, disegnare le aree di interesse attorno a ciascuno dei singoli polmoni e fare clic su misura. BIRFLU è stato caratterizzato in vitro determinando i livelli di espressione di Venere, Nluc e NP nelle cellule infette.
L'espressione di Venere e Nluc viene rilevata solo nelle cellule infettate da BIRFLU, mentre l'NP è espresso sia in cellule di tipo selvatico PR8 che in cellule infettate da BIRFLU. Nessuna espressione è osservata nelle cellule finte infette. Inoltre, l'attività di Nluc è stata misurata in supernanti di coltura tissutale a 24, 48, 72 e 96 ore dopo l'infezione.
Viene rilevato già 24 ore dopo l'infezione e i livelli di espressione aumentano a 96 ore. Si può anche dimostrare che la cinetica di replicazione di BIRFLU è paragonabile al virus PR8 di tipo selvatico. BIRFLU ha la capacità di esprimere geni reporter sia fluorescenti che bioluminescenti, e la correlazione tra i due può essere valutata utilizzando l'imaging in vivo ed ex vivo di un polmone di topo.
I polmoni dei topi infetti da BIRFLU mostrarono un'alta bioluminescenza in vivo e fluorescenza ex vivo. Sono stati inoltre determinati tatri virali e stabilità genetica di BIRFLU in vivo. Test di placca sui virus dei polmoni del topo hanno dimostrato che il virus può formare placche ed esprimere entrambi i geni reporter.
BIRFLU potrebbe anche essere utilizzato per valutare l'efficacia degli anticorpi antivirali e neutralizzanti contro l'influenza. L'output di questi saggi era tutto correlato tra loro e sono veloci e facili da fare.
