Gli autori ringraziano i membri Cirillo laboratorio per le discussioni di valore e di assistenza in tutto questo studio. Ringraziamo il Dr. Joshua Hill e il laboratorio del Dr. James Samuel per assistenza durante le riprese di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla borsa 48523 dalla Bill &amp; Melinda Gates Foundation e concedere AI47866 dal National Institutes of Health.

1. Infezione polmonare da intubazione intratracheale <ol><li> Pesare topi e, opzionalmente, i marchi possono essere fatti sulle orecchie per una facile identificazione. </li><li> Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg per g di peso del mouse) e xilazina (10 mg per g di peso del mouse) per inoculazione intraperitoneale. </li><li> Topi posto nelle gabbie fino completamente anestetizzato. Spremere le pastiglie dei loro piedi per controllare pedale riflesso. I topi dovrebbe visualizzare ridotta o nessuna reazione riflessa. </li><li> Posizionare il mouse sul supporto intubazione sdraiato sulla schiena. </li><li> Fissare un elastico a stare intubazione e poi metterlo sotto gli incisivi superiori del mouse. Utilizzare del nastro per fissare le gambe e le braccia sul supporto intubazione. </li><li> Spostare delicatamente tougue dalla bocca con pinze. </li><li> Inserire speculum con octoscope all&#39;interno della bocca e guardare in orofaringe fino all&#39;apertura della laringe è visibile. </li><li> Filo guida anticipo coperto con cathether in trachea fino catether hub è al incisivi. Rimuovere il filo guida. Mettere in aria cathether per osservare l&#39;espansione del torace e confermare l&#39;intubazione corretta. </li><li> Iniettare 50 ml di batteri (nelle immagini mostrate abbiamo usato bacillo di Calmette Guerin (BCG) che esprime clicca scarabeo rosso luciferasi (CBRLuc), costruito nel nostro laboratorio, ma ogni sforzo luminescenti batterica può essere utilizzato) soluzione attraverso cathether usando una siringa da 1 ml. </li><li> Posizionare il mouse in una gabbia e osservarlo durante il recupero dall&#39;anestesia. </li></ol> 2. Animali anestesia e preparazione per l&#39;imaging bioluminescenza I topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando il XGI-8 Sistema Gas Aneshesia. <ol><li> Prima di utilizzare il sistema-8 XGI anestesia, pesare ogni canestro filtro al carbone e scrivere il peso e la data su di esso. Se il peso è di 50 grammi sopra del peso iniziale, sostituirlo con un nuovo contenitore. </li><li> Controllare il livello isoflurano nel vaporizzatore e riempire se necessario. </li><li> Accendere la pompa di evacuazione nella parte anteriore del XGI-8 sistema di anestesia e impostato su 8 lpm (litri per minuite). </li><li> Accendere la fornitura di ossigeno dal cilindro ad alta pressione e impostarlo a 55 psig. </li><li> Accendere l&#39;ossigeno passare (in verde) sulla parte anteriore del sistema-8 XGI anestesia. </li><li> Accendere il flusso di gas alla camera di imaging per impostare il livello di flusso del gas. Impostato a 0,25 litri al minuto e poi spegnere il flusso del gas. </li><li> Accendere il flusso di gas alla camera di induzione dell&#39;anestesia per impostare il livello di flusso del gas. Impostato a 1,5 litri al minuto e poi spegnere il flusso del gas. </li><li> Accendere il isoflurano con il vaporizzatore e si mise al 2-2,5 per cento. Il livello di isoflurano può essere regolata a seconda del numero di animali utilizzati e il peso. </li><li> Luogo topi nella camera di induzione e chiudere il coperchio. Accendere il flusso di gas alla camera di induzione. Topi posto nella camera per 5 - 10 minuites fino a quando sono anestetizzare completamente. </li><li> Applicare una pomata ottico agli occhi per proteggere gli occhi del mouse durante l&#39;imaging e posizionare il mouse nella camera di imaging in uno dei coni naso sul collettore di anestesia. Usa deflettore luce tra i topi per evitare il riflesso della luce su soggetti animali adiacenti. </li><li> Iniettare luciferina (150 mcg / grammo di peso corporeo) per inoculazione intraperitoneale. </li></ol> 3. Bioluminescenza Imaging <ol><li> Avviare il software di imaging Living. </li><li> Se il sistema non è stato inizializzato, inizializzare il sistema di Imaging IVIS. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;imaging, cliccando configurazione sequenza nel pannello di controllo acquisizione IVIS. Seleziona luminescenza e fotografare in modalità Imaging. Se l&#39;opzione per effettuare DLIT ricostruzione 3D è desiderata, selezionare le immagini luce fotografica, luminescenti e strutturale come parte della sequenza di immagini. Impostare tempo di esposizione da 0,5 sec a 10 minuti. Impostare Binning e F / stop sulla base di luminosità prevista di campione. Impostare eccitazione filtro per bloccare e filtrare le emissioni di aprire, a meno che progettando di acquisire specifiche lunghezze d&#39;onda solo di luce. Nel caso di costituzione DLIT 3D, impostare filtri di emissioni multiple di diverse lunghezze d&#39;onda per permettere la localizzazione precisa della fonte. Set FOV da A a D a seconda del numero di topi o della regione di animali da acquisire. Selezionare A e B per 1 mouse, C per 2-3 topi, e D per 4-5 topi. </li><li> Clicca aggiungere nella procedura guidata immagine nel Pannello di controllo di acquisizione per aggiungere la sequenza di setup. </li><li> Avviare la sequenza di immagini, cliccando acquisire. In caso di costruzione DLIT 3D, immagini luminescenti saranno acquisite per i filtri delle emissioni a diverse lunghezze d&#39;onda multiple. Immagini fotografiche della luce e strutturati saranno acquisite anche. </li><li> Durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e modificare i livelli di immagine pannelli saranno visibili. Compila il più possibile dettagliate per ciascun esperimento in modifica immagine per assicurare un facile monitoraggio di immagini in tempi successivi e salvare le immagini. </li><li> ReRemove i topi da IVIS immagini da camera e restituirli alle loro gabbie. Osservare il recupero da unesthesia per assicurare i topi non sono state influenzate dalla procedura. Gli animali devono essere monitorati costantemente fino a quando non riprendersi completamente da anestesia (di solito 1-2 minuti). </li></ol> 4. Ex vivo Imaging e Analisi CFU per la quantificazione dei batteri nei polmoni <ol><li> Iniettare topi con luciferina intraperitoneale nello stesso modo come per l&#39;imaging, appena prima di eutanasia. </li><li> Euthanize i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg pentobarbitol 5 minuti dopo l&#39;iniezione luciferina. </li><li> Espianto i polmoni dei topi e il luogo in sterili petri-piatti con pinza sterile e forbici. </li><li> Luogo petri-piatto contenente organo espiantato in camera di imaging e di acquisire immagini bioluminescenza nello stesso modo come per il mouse tutto. </li><li> Dopo l&#39;imaging, rimuovere organi espiantati da Petri con pinze sterili e omogeneizzare in 1 ml di PBS. </li><li> Diluire e del tessuto piatto sul supporto più appropriato selettivo. Tessuto omogeneizzato può essere conservato -80 ° C per la ri-placcatura se fosse necessario. In alternativa, il tessuto omogeneizzato può essere utilizzato per l&#39;estrazione del DNA o RNA per quantificare i numeri batterica da qPCR. </li></ol> 5. Analisi di Imaging Luminescenza <ol><li> Start &quot;Imaging Software Vivere&quot; e sfogliare i file di immagine. </li><li> Usare &quot;Tool Palette &#39;per regolare le immagini. Clicca l&#39;immagine Regolare di modificare la correzione / filtraggio impostazioni e min / max per le scale di colore individuali. </li><li> Utilizzare strumenti di ROI nella lista a tendina per la quantificazione dell&#39;intensità luminosa. Seleziona il ROI forma, numero e dimensioni. Trascinare il ROI cornice alla regione di interesse sull&#39;immagine. Assicurarsi che tutte le ROI sono della stessa dimensione e forma. Clicca ROI misura e salvare, copiare e / o esportare dati quantitativi. </li><li> Nel caso di DLIT ricostruzioni 3D, caricare sequenza di immagini tra cui l&#39;immagine luce strutturata. Clicca topografia superficiale nello strumento Platte. Nella lista a discesa, fare clic sulla scheda Ricostruire per generare la topografia della superficie. Un pasticcio superficie apparirà nella finestra. </li><li> Seleziona ricostruzione 3D DLIT nello strumento Platte. Nella lista a tendina, selezionare la scheda Proprietà per impostare le proprietà dei tessuti e lo spettro sorgente. Muscolare è consigliato nella maggior parte delle circostanze. Nell&#39;elenco a discesa, fare clic sulla scheda Analizza per selezionare la lunghezza d&#39;onda per l&#39;analisi. Fare clic sulla scheda Parametri e confermare i valori di default o regolare i parametri DLIT se necessario. Clicca sulla scheda Ricostruire per iniziare l&#39;analisi 3D. </li><li> Quando la ricostruzione 3D è finito, la vista 3D mostrerà i risultati della ricostruzione 3D. Fare clic sulla scheda dei risultati per visualizzare i dati di analisi per la densità di fotoni, voxel e parametri dell&#39;algoritmo DLIT. </li><li> Salvare e / o esportare i risultati delle analisi ricostruzione 3D in figure e file di dati. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Le immagini bioluminescenza di topi infettati con batteri bioluminescenti insieme ad un controllo del mouse non infetti sono mostrati in Figura 1. Il polmonare topi infettati con batteri bioluminescenti produrre segnale significativo dai polmoni (Figura 1). L&#39;intensità di luminescenza è quantificato come flusso totale in un ROI (regione di interesse) (Figura 2). I dati quantitativi per l&#39;intensità della luce è normalizzato per unità formanti colonia (CFU) di batteri ottenuti da polmoni per confermare che il segnale viene prodotto dai batteri bioluminescenti e può essere paragonato al controllo negativo. La posizione e l&#39;intensità del segnale può essere ulteriormente analizzato da DLIT ricostruzione 3D della sorgente luminescente basata su tomografia della superficie del mouse 11. Queste analisi permettono la quantificazione e la localizzazione del segnale bioluminescente prodotto. I risultati di ricostruzione 3D di una fonte luminescente in topi infettati dimostra che la luce è prodotta dai polmoni del mouse (Figura 3). Le immagini ex vivo dei polmoni del mouse risultante confermare che luminescenza emessa dai polmoni, piuttosto che qualche altro tessuto o organo strettamente giustapposti (Figura 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Di imaging polmonare luminescenza di topi infettati con batteri bioluminescenti taggati con CBRluc. Controllo del mouse non infetti è a sinistra e due topi infettati sono sulla destra. I topi sono stati infettati con batteri che esprimono CBRluc (n = 2) per via intratracheale. 10 minuti dopo l&#39;iniezione luciferina, luminescenza immagini sono state acquisite per 10 minuti a 4 posizioni: dorsale, ventrale, lato sinistro e lato destro. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. L&#39;intensità della luce quantitative da topi infettati con batteri che esprimono CBRluc. (A, B) le immagini di luminescenza di analisi del ROI e il flusso totale di luce quantificati dal ROI in posizione dorsale e ventrale, rispettivamente. Topi infetti sono a sinistra e due topi infettati sono sulla destra. Luminescenza immagini sono state acquisite dai polmoni of topi infetti e non infetti con CBRlux (n = 2). L&#39;intensità della luce intorno polmoni è stata quantificata mediante l&#39;analisi del ROI. C) Immagini ex vivo di polmoni da non infetti (in alto) e infettati (in basso due set di polmoni) topi. Luciferina è stato iniettato 5 miniuts prima di eutanasia e le immagini sono state poi acquisite. I valori quantificati sono normalizzati a CFU. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La ricostruzione 3D della fonte bioluminescenza (s) da un topo polmonare infettato. Il mouse è stato infettato da batteri che esprimono CBRluc per iniezione intratracheale. La sequenza di immagini è stata acquisita utilizzando filtri di emissione diversi di lunghezze d&#39;onda di serie da 540 nm a 700 nm. Una sequenza di immagini è stato utilizzato per la ricostituzione 3D per fonte di luminescenza in soggetti animali che conteneva un imag strutturato. A) La tomografia per mouse è mostrato in diverse posizioni: davanti, dietro, destra e sinistra. Le sorgenti luminose sono mostrati come voxel (caselle rosse all&#39;interno del mouse 3D) che si trovano all&#39;interno del polmone come determinato dalla ricostruzione. B) Photon mappa densiy dei dati misurati e simulati. Confrontando i misurati e simulati curve di densità di fotoni fornire le informazioni di qualità della ricostruzione. Buon risultato di qualità ricostruzioni in simili densità misurati e simulati fotone.

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

Studi su animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Texas A &amp; M University.

Anche se dopo questi protocolli di solito provoca immagini di alta qualità, è importante prendere in considerazione alcuni punti chiave per ottenere dati precisi e coerenti da studi di imaging. Luminescenza immagini dovrebbero essere acquisite che hanno conti da 600 a 60.000 per assicurare che il segnale è al di sopra di fondo e la fotocamera non è saturo. Se il segnale ottenuto è minore di 600 le condizioni di esposizione deve essere regolata per incrementare la conta. Se il segnale ottenuto è di oltre 60.000 la ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

Imaging è una tecnica preziosa che può essere utilizzata per monitorare i processi biologici. In particolare, la presenza di cellule tumorali, cellule staminali, specifici tipi di cellule immunitarie, agenti patogeni virali, parassiti e batteri possono essere seguiti in tempo reale all&#39;interno di animali viventi 1-2. Applicazione di imaging bioluminescenza per lo studio di agenti patogeni presenta vantaggi rispetto alle strategie tradizionali per l&#39;analisi delle infezioni in modelli animali 3-4. Le infezioni possono essere visualizzati all&#39;interno di un singolo animale, nel tempo, senza richiedere l&#39;eutanasia per determinare la posizione e la quantità del patogeno. L&#39;imaging ottico permette la visione completa di tutti i tessuti e organi, piuttosto che il campionamento dei siti precedentemente nota l&#39;infezione. Inoltre, l&#39;accuratezza della inoculazione in tessuti specifici possono essere direttamente determinato prima di portare gli animali in avanti che sono stati inoculati senza successo in tutto l&#39;intero esperimento. Variabilità tra gli animali possono essere controllati per, dal momento che l&#39;imaging permette ad ogni animale da seguire individualmente. Imaging ha il potenziale per ridurre notevolmente il numero degli animali necessari a causa della possibilità di ottenere dati da numerosi punti di tempo, senza dover tessuti campione per determinare il carico patogeno 3-4. Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le infezioni negli animali vivi utilizzando l&#39;imaging bioluminescenza di ceppi di batteri ricombinanti che esprimono luciferasi. Lo scarabeo clic (CBRLuc) e luciferases lucciola (FFluc) utilizzano come substrato luciferina 5-6. La luce prodotta da entrambe le CBRluc e FFluc ha una lunghezza d&#39;onda largo da 500 nm a 700 nm, rendendo questi giornalisti luciferases eccellente per l&#39;imaging ottico in modelli animali che vivono 7-9. Ciò è dovuto soprattutto lunghezze d&#39;onda della luce superiore a 600 nm sono necessari per evitare l&#39;assorbimento da parte dell&#39;emoglobina e, quindi, i viaggi attraverso il tessuto dei mammiferi in modo efficiente. Luciferasi è geneticamente introdotto i batteri per produrre segnale luminoso 10. I topi sono polmonare inoculati con batteri bioluminescenti intratracheally per consentire il monitoraggio delle infezioni in tempo reale. Dopo l&#39;iniezione luciferina, le immagini sono acquisite con il Imaging System IVIS. Durante l&#39;imaging, i topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando un XGI-8 Sistema Gas Anethesia. Le immagini possono essere analizzati per localizzare e quantificare la sorgente del segnale, che rappresenta il sito di infezione batterica (s) e il numero, rispettivamente. Dopo l&#39;imaging, la determinazione CFU viene effettuata sul tessuto omogeneizzato per confermare la presenza di batteri. Diverse dosi di batteri vengono utilizzati per correlare numeri batterica con luminescenza. L&#39;imaging può essere applicato allo studio della patogenesi e la valutazione dell&#39;efficacia di composti antibatterici e vaccini.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Metodi per l&#39;imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l&#39;imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K Views.  Texas A&M Health Science Center. Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Video: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Valutazione della risposta stomatica a Live cellule batteriche utilizzando Imaging Whole Leaf

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Utilizzando il protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezioni di origine alimentare nelle larve di Zebrafish

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...