Name: a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
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Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da Sapienza Università di Roma e la Fondazione ricerca fibrosi cistica (progetto FFC #11/2014 adottato dalle delegazioni FFC da Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny e Pavia). Parte di questo lavoro è stata anche sostenuta da FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Siamo grati al Dr. Loretta Ferrera (u.o.c. di Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italia) per la fornitura di cellule epiteliali bronchiali.

1. cella preparazione
<ol><li>Semi 2.5x106 celle in 10 mL di minimo essenziale medio (MEM) completato con glutamina 2mm (MEMg), più 10% siero bovino fetale (FBS), antibiotici (0,1 mg/mL di penicillina e streptomicina) e con puromicina (0,5 µ g/mL per la selezione e la manutenzione dei linea cellulare) in un matraccio da T75. Incubare la beuta a 37 ° C e 5% CO2 per 2 giorni. Prima di iniziare l'esperimento, verifica la confluenza delle cellule sotto un microscopio invertito. Nota: Le celle utilizzate per l'esperimento sono cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate trasformate con un vettore lentivirale che conferiscono resistenza agli con puromicina. Essi esprimono stabilmente un funzionale CFTR14,15.</li>
	<li>Una volta che ha raggiunto la confluenza delle cellule 90-100%, aspirare il mezzo dal pallone e gettarlo in una bottiglia dei rifiuti nell'ambito di una classe di armadio di sicurezza biologica II. Lavare le cellule con 6 mL di tampone fosfato salino senza calcio e magnesio (CMF-PBS). Delicatamente la boccetta della roccia manualmente ed eliminare CMF-PBS. Nota: Fare attenzione a non toccare il monostrato cellulare con la pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di PBS CMF e incubare la beuta a 37 ° C e 5% di CO2 per 10 min.</li>
	<li>CMF-PBS di aspirare ed eliminare. Quindi aggiungere 2 mL di tripsina/EDTA al pallone.</li>
	<li>Scuotere delicatamente il matraccio, lasciare che la soluzione completamente ricoprire le cellule ed incubare la beuta a 37 ° C e 5% di CO2 per 10 min, fino a quando le cellule sono visibilmente staccate sotto un microscopio. Nota: Al termine del tempo di incubazione, le cellule dovrebbero apparire arrotondato e non attaccato alla superficie plastica. Se le cellule non sono ben staccate, agitazione manuale può essere necessario.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di MEMg maggiorato del 10% FBS per inattivare tripsina e raccogliere le cellule lavando il fondo del pallone. Trasferire il volume in una provetta conica 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la provetta per 5 min a 80 x g.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 6 mL di MEMg plus 10% FBS. Pipettare ripetutamente per eliminare eventuali grumi.</li>
	<li>Prendere 10 µ l di sospensione cellulare con una micropipetta e iniettare il volume sotto il vetro di copertura precedentemente messo sopra una camera di Burker o Neubauer.</li>
	<li>Contare il numero di cellulare.</li>
</ol>2. semina nella coltura cellulare inserti
<ol><li>In ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti, trasferire l'inserto di cultura con pinzette sterili (Figura 1). Utilizzare una pinzetta per premere lungo i bordi di inserti per ripararli alla superficie della piastra. Nota: Gli inserti hanno un lato appiccicoso che permette l'adesione.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentazione schematica degli inserti in silicone cultura, correttamente messo in pozzetti di una piastra 12-pozzetti. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Diluire correttamente la sospensione cellulare in MEMg maggiorato del 10% FBS. Riempire ogni scomparto dell'inserto con 70 µ l di sospensione cellulare (circa 3.5x104 cellule/camera). Nota: La densità delle cellule applicata in ogni compartimento dipende dal tipo delle cellule. Si consiglia di utilizzare una densità delle cellule che conduce per completare confluenza entro 24 h.</li>
	<li>Sotto il microscopio, verifica che le cellule non sono perdite dai comparti inserto e incubare la piastra 12-pozzetti per 24 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
</ol>3. pseudo-ferita guarigione Assay
<ol><li>Dopo l'incubazione, visualizzare le cellule al microscopio invertito per verificare che sono stati formati strati monomolecolari della cellula confluenti.</li>
	<li>Risospendere le sostanze da testare (ad es., AMPs) in 1 mL di MEMg. Nota: Preparare diluizioni di AMPs freschi a partire dalla soluzione stock conservata a-20 ° C.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente gli inserti di pinzette sterili. Fare attenzione a non rompere i monostrati di cellule umane. Trasferire gli inserti sulla carta assorbente. Nota: Per riutilizzare gli stessi inserti, sterilizzarli in etanolo al 70% per almeno 3 ore. Si consiglia di buttarli via in seguito.</li>
	<li>Per rimuovere le cellule non-aderenti, aggiungere 1 mL di MEMg al bene utilizzando una micropipetta. Chiudere la piastra e scuoterla delicatamente. Nota: Non aggiungere il terreno direttamente sulla cima di monostrati di cellule umane per evitare il loro malfunzionamento.</li>
	<li>Aspirare il mezzo e sostituirlo con 1 mL di MEMg per bene. Chiudere la piastra e visualizzare le lacune senza cellula (create dagli inserti) sotto il microscopio invertito con un ingrandimento 4x, dotato di una videocamera. Acquisire immagini a tempo zero (T0) e salvarli in formato. jpg.</li>
	<li>Rimuovere il supporto dai pozzi, lavarli con 1 mL di PBS e scartarla.</li>
	<li>Aggiungere le sostanze da testare (preparati al punto 3.2) ai pozzetti. Per i campioni di controllo non trattato, aggiungere 1 mL di MEMg. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 15, 20 e 24 trattamenti di h, osservare la migrazione delle cellule sotto il microscopio con un ingrandimento 4x e acquisire immagini. Nota: Durante questo passaggio, tenta di catturare immagini nelle stesse zone per quanto riguarda T0. La scelta di intervalli di tempo in cui le immagini sono acquisite dipende dalla velocità di migrazione delle cellule.</li>
	<li>Per studiare l'effetto di alcuni inibitori selettivi, cioè AG1478, sulla migrazione cellulare, aspirare il mezzo da ogni alloggiamento prima di rimuovere inserti.<ol>
<li>Lavare ogni vano con MEMg fresco e riempirlo con 70 µ l di MEMg completati con AG1478.</li>
		<li>Dopo 30 min di incubazione a 37 ° C e 5% CO2, procedere come descritto dal punto 3.3. Nota: Durante la fase di lavaggio e di pretrattamento di monostrati di cellule umane con inibitori specifici, fare attenzione a non rimuovere gli inserti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Al termine dell'esperimento, selezionare le immagini dei campioni più rappresentativi dei vari gruppi sperimentali e creare un file zip contenente immagini singole a T0, T15, T20 e T24 h. Nota: Le singole immagini sono presi intervalli di tempo selezionati per tutti i campioni. Eseguire triplici copie per ogni esperimento, che viene ripetuto almeno tre volte. Alla fine, per gruppi tutti sperimentali, un minimo di 3 immagini ("a", "b", "c", ecc., derivanti da ogni esperimento indipendente) in ogni punto del tempo vengono analizzati.</li>
	<li>Caricare il file zip nel software di analisi di immagine che fornisce automaticamente via e-mail un file di foglio di calcolo di riepilogo contenente i dati sperimentali delle zone rivestite in cella e gratta e Vinci (come percentuale) presso i punti di tempo selezionato. Nota: Il riconoscimento della leading edge e la zona di gap è in gran parte basato su metodo di rilevamento del bordo (volto a identificare i punti in cui la luminosità dell'immagine cambia bruscamente).</li>
	<li>Salvare i dati e raccoglierli. Normalizzare tutti i dati per quanto riguarda il valore medio a tempo zero. Calcolare il valore medio dei dati normalizzati di tutte le repliche a ogni punto del tempo e l'errore standard relativo (SEM). Mediante analisi della varianza (ANOVA) bidirezionale, effettuare analisi statistiche, con un software di statistiche adeguate. Differenze tra gruppi di peptide-trattati e controllo a diversi intervalli di tempo sono considerate essere statisticamente significativo per una p< 0.05.</li>
	<li>Tracciare i dati ottenuti in un grafico come un istogramma che mostra la percentuale di area delle cellule di tutti i campione gruppi contro gli intervalli di tempo selezionati.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients:+an+update.">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li><li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+wound+healing:+biological+and+therapeutic+considerations.">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li><li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li><li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing.">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li><li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology:+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology.">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li><li>Lai, Y., Gallo, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner:+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing?.">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?.</a> PLoS One. 10, e0128663 (2015).</li><li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a(1-21)NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions.">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li><li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration:+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action.">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li><li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers.">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li><li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue.">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li><li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806.">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li><li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus.">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Migrazione delle cellule è un processo essenziale in molti eventi fisiologici e patologici, tra cui la guarigione della ferita, lo sviluppo embrionale e metastasi del cancro. La procedura di base per studiare la migrazione delle cellule in vitro comporta: (i) la creazione di un monostrato di cellule, (ii) la produzione di una pseudo-ferita nello strato confluente di cellule, (iii) l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo diversi fino a quando ferita chiusura viene raggiunto e (iv) l'analisi della sequen...

È ampiamente noto che la guarigione arrotolata negli animali è un processo fondamentale per ristabilire l'integrità e la funzione normale di strati di tessuto dopo lesioni1. Nonostante le superfici epiteliali esposte all'ambiente esterno (ad es., pelle, vie respiratorie e tratti gastrointestinali) formano una barriera protettiva dagli insulti chimici e fisici, la formazione di ferite può facilmente verificarsi, soprattutto dopo chirurgia o infezioni microbiche2. Ad esempio, la colonizzazione del tessuto polmonare di agente patogeno batterico opportunistico Pseudomonas aeruginosa, soprattutto in chi soffre di fibrosi cistica (CF), porta a danni dell'epitelio airways con conseguente insufficienza respiratoria3, 4. La guarigione della ferita è un meccanismo di riparazione complessi host per ripristinare la normale architettura di un tessuto danneggiato5. È caratterizzata da infiammazione iniziale, seguita da un periodo di rigenerazione che comprende epithelialization, angiogenesi e rimodellamento tissutale con la produzione di collagene e cellule differenziazione6,7,8 . Per garantire l'integrità epiteliale e per controllare la proliferazione microbica, tutti gli organismi viventi producono molecole di difesa, tra cui peptidi antimicrobici (amp)9,10. Il processo di guarigione della ferita è molto difficile da simulare in vitro a causa della mancanza di detriti cellulari e delle complesse interazioni tra diversi tipi di cellule. Tuttavia, la capacità in vitro di un peptide di accelerare la chiusura di una pseudo-ferita di stimolando la migrazione delle cellule epiteliali è indicativa della sua capacità di guarire un epitelio compromesso. Infatti, migrazione delle cellule è un evento di tasso-di limitazione nella guarigione delle ferite, e studiare i fattori che possono influenzare la migrazione cellulare vi aiuterà a terapie target per una migliore cicatrizzazione.
Qui, un'analisi sperimentale altamente riproducibile viene fornita in base su inserti in silicone speciale cultura per valutare di migrazione delle cellule in vitro. Si basa sulla creazione di un 500 μm gap (pseudo-ferita) su un monostrato di cellule confluenti. Le cellule al bordo del campo artificiale "ferito" inizierà la migrazione nell'area senza cellula, formando nuovi contatti cellula-cellula. L'inserto di cultura rappresenta un nuovo strumento per esperimenti di cicatrizzazione veloce. Sono forniti due serbatoi separati da una parete di 500 μm, e possono essere inseriti correttamente in una piastra di 3 cm piatto o nel pozzetto di una piastra 12-pozzetti. Ogni vano dell'inserto di riempimento con una sospensione cellulare permette alle cellule di crescere in ogni area designata fino alla confluenza, mentre la rimozione dell'inserto e concernente un gap pulito privo di cella di circa 500 μm (la stessa larghezza come il muro di separazione). Un mezzo di coltura cellulare adeguata completato con un composto in esame può essere quindi aggiunto nel piatto piatto/pozzetto. In seguito, la chiusura del divario possa essere visualizzata a intervalli di tempo differenti sotto un microscopio invertito, preferibilmente uno dotato di una videocamera per acquisizione di immagini. Misurazione delle variazioni nella zona cella-coperti dal programma di analisi di immagine automatizzata basata su web consentirà, infine, la quantificazione della velocità di migrazione delle cellule e la chiusura della ferita. Nel complesso, questo metodo è un passo avanti per quanto riguarda il dosaggio classico, dove un graffio fatta manualmente dal pungere monostrati confluenti di cellule umane con un ago sterile o una pipetta11suggerimento. Infatti, l'ultima procedura può distruggere il fondo in plastica del piatto piatto/pozzetto ed il rivestimento di superficie, creando le rughe. Inoltre, l'area "ferito" non ha una larghezza ben definita lungo l'intera lunghezza del gap, come questo altamente dipende dalla pressione applicata dai ricercatori alla punta dell'ago. Inoltre, le cellule sloggiate possono formare grumi di cellule vive e morte ai bordi del graffio; Inoltre, la diffusione delle cellule viventi nell'area "ferito" può interferire con la velocità della migrazione cellulare, generando risultati non riproducibili12.
Inoltre, grazie ad una piattaforma di analisi di immagine gratta e Vinci, gli utenti possono rapidamente ricevere (in minuti) dati quantitativi sul comportamento migratorio delle celle selezionate senza la necessità di acquisizione di software aggiuntivo. Questa piattaforma è in grado di analizzare le immagini di microscopia di contrasto di fase di bassa (~ 5 X), media (~ 10x) e alto (~ 20 X) ingrandimento. Dopo aver caricato un file zip di immagini (in *. jpg, *. jpeg, *.jp2, *. png, *. gif, formato TIFF) l'analisi è condotta automaticamente per generare un file di riepilogo che mostra la percentuale di zone coperte di cella e di aree gratta e Vinci, così come la velocità della cella migrazione, a intervalli di tempo distinti.
In questo lavoro, utilizzando un Rana-pelle AMP-derivato, cioè Esc(1-21) e relativo diastereomer Esc(1-21) - 1C13e una linea di cellule bronchiali esprimendo il funzionale CF conduttanza transmembrana regolatore (CFTR)14,15, viene fornito un esempio di migrazione cellulare indotta da peptide in confronto con campioni non trattati (controllo). Si noti che l'epitelio delle vie aeree e la CFTR gioca un ruolo cruciale nel mantenimento della funzione polmonare e la ferita riparazione16. Inoltre, per mezzo di inibitori selettivi (ad es., AG1478)17 del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), prova che la migrazione di cellule bronchiali indotta dai peptidi di cui sopra comporta l'attivazione di EGFR12, 18 è segnalato.
In sintesi, l'obiettivo di questa procedura è di dimostrare come l'utilizzo di tali inserti di cultura in silicone rappresenta un'analisi veloce e facilmente accessibile per determinare con precisione la migrazione di cellule aderenti (ad es., cellule epiteliali bronchiali) e molecolare meccanismi di controllo di tali eventi.

<table><tbody><tr><td>Minimum essential medium (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 1X in PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Insert 2 well</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis Image Analysis</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISM software&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>version 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare un nuovo metodo per valutare la capacità di alcune molecole di immunomodulatori, quali peptidi antimicrobici (amp), per stimolare la migrazione cellulare. D'importanza, migrazione delle cellule è un evento limitante durante il processo di guarigione della ferita per ristabilire l'integrità e la funzione normale di strati di tessuto dopo la ferita. Il vantaggio di questo metodo oltre l'analisi classica, che si basa su un graffio fatto manualmente in un monostrato di cellule, è che l'utilizzo della cultura di silicone speciale inserisce fornendo due scomparti per creare un campo di pseudo-ferito senza cellula con una larghezza ben definita (500 μm ). Inoltre, a causa di una piattaforma di analisi di immagine automatizzato, è possibile ottenere rapidamente i dati quantitativi sulla velocità di migrazione delle cellule e la chiusura della ferita. Più precisamente, verrà mostrato l'effetto di due amplificatori di pelle di rana sulla migrazione di cellule epiteliali bronchiali. Inoltre, il pretrattamento di queste cellule con inibitori specifici fornirà informazioni sui meccanismi molecolari alla base di tali eventi.

Questo protocollo è stato usato per determinare l'effetto di Esc(1-21) ed Esc(1-21) - 1C in termini di attività di migrazione delle cellule indotto in cellule epiteliali bronchiali che esprimono la proteina CFTR funzionale di cicatrizzazione. In questo saggio, inserti di cultura sono stati collocati nei pozzetti di una piastra 12-pozzetti, e ogni scomparto è stato seminato con 35.000 cellule in MEMg supplementato con 10% FBS. Le cellule raggiunto confluenza completa entro 24 h. in segu...

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A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'effetto dei peptidi sulla migrazione di cellule epiteliali bronchiali. Questo metodo consente l'ottenimento rapido e altamente riproducibile di dati quantitativi sulla velocità di chiusura della ferita e migrazione cellulare.

Un romanzo In Vitro ferita guarigione test per valutare la migrazione cellulare

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

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Immunology and Infection

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

21.7K Views.  Sapienza University of Rome. Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'effetto dei peptidi sulla migrazione di cellule epiteliali bronchiali. Questo metodo consente l'ottenimento rapido e altamente riproducibile di dati quantitativi sulla velocità di chiusura della ferita e migrazione cellulare.

Video: A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Ricerca sul cancro

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

In Vitro Scratch test per dimostrare gli effetti dell'arsenico su migrazione delle cellule della pelle

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Ambiente

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Bioingegneria

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medicina

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biologia

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.

Un romanzo In Vitro ferita guarigione test per valutare la migrazione cellulare

Riepilogo

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Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l'esposizione a sostanze chimiche tossiche