Il protocollo è usato per la mutagenesi di saturazione di un sito di legame proteico. Se il sito di legame proteico non è noto, può essere identificato utilizzando questo protocollo. La tecnica ha rilevanza per la diagnosi e la terapia della malattia.
Credo che il suo pieno potenziale nelle scienze biomediche resti da sfruttare appieno. Questo metodo può essere ampiamente applicato a qualsiasi proteina o reazione in cui le molecole desiderate possono essere separate da molecole indesiderate. Assicurarsi che la libreria sia adeguatamente randomizzata e assicurarsi che durante ogni fase di legame e separazione l'arricchimento delle molecole desiderate sia elevato.
Si tratta di diversi passaggi e molti dettagli che sono meglio dimostrati, piuttosto che spiegati a parole. Dopo aver visto questo video, dovresti essere a tuo agio con come preparare una libreria casuale, sintetizzare un pool di RNA iniziale ed eseguire una reazione di legame a molecole desiderate e indesiderate separate per ottenere alta affinità e leganti specifici. In primo luogo, sintetizzare il primer in avanti e il primer inverso mediante sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA.
Inoltre, sintetizzare un modello di oligonucleotide libreria casuale con 31 posizioni randomizzate. In un tubo PCR, mescolare un modello di libreria casuale di DNA micromolare, un primer forward micromolare contenente promotore di polimerasi T7 RNA e primer inverso, Tris da 20 millimolare a pH otto, cloruro di magnesio acemolare da 1,5 millimolare, cloruro di potassio da 50 millimolare, albumina di siero bovino acetilato da 1 microgrammi per millilitro, due unità di Taq polimerasi e 200 micromolari ciascuno di dNTP. Impostare la macchina PCR con cinque cicli di denaturazione, ricottura e passaggi di estensione, seguiti da un ciclo di estensione per collegare il promotore alla libreria del DNA.
Impostare una reazione di trascrizione di 100 microlitri contenente buffer di trascrizione T7, DNA del pool di libreria casuale un micromolare, DTT da cinque millimolare, GTP bi millimolare, un millimolare ciascuno di ATP, CTP e UTP e due unità per microlitro T7 RNA polimerasi. Ora indossa uno scudo di vetro acrilico e guanti. Introdurre la radioattività aggiungendo 5 microlitri o meno di UTP alfa-32P nella reazione di trascrizione per l'autoradiografia.
Incubare la miscela di reazione in un tubo di microcentrifugo per due ore a 37 gradi Celsius. Per purificare in gel l'RNA, preparare un gel di poliacrilammide denaturante al 10%. Caricare campioni nei pozzi del gel.
Esporre il gel a una pellicola a raggi X e identificare la posizione delle trascrizioni sul gel e tagliare la fetta di gel. Posizionare la fetta di gel in un tubo di centrifuga e rompere in pezzi più piccoli con una punta omogeneizzante. Aggiungere il tampone proteinasi K per immergere i pezzi di gel.
Lasciare il tubo su un nutator per almeno due ore a temperatura ambiente. Quindi ruotare in un microcentrifugo ad alta velocità per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere i detriti del gel e recuperare la soluzione tampone. Aggiungere un volume uguale di fenolo-cloroformio nel tubo con il supernatante, il vortice e la centrifuga.
Ripetere l'estrazione con fenolo-cloroformio ancora una volta e poi con cloroformio ancora una volta. Successivamente, mescolare la fase acquosa del tampone di proteinasi K con 1/10 volume di acetato di sodio trimolare a pH 5,2, 10 microgrammi di tRNA o 20 microgrammi di glicogeno e da due a tre volumi di etanolo conservati a meno 20 gradi Celsius. Lasciare il tubo a meno 80 gradi Celsius per un'ora.
Ruotare il tubo contenente la soluzione per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius in un microcentrifugo. Scartare attentamente il supernatante e aggiungere il 70% di etanolo per risciacquare il pellet di RNA. Gira da due a cinque minuti.
Aspirare attentamente l'etanolo e asciugare all'aria il pellet di RNA. Quindi, aggiungere 50 microlitri di acqua trattati con DEPC per solubilizzare il pellet di RNA. Lasciare il campione a meno 20 gradi Celsius per la conservazione.
Per legare proteine e RNA in un volume di reazione di 100 microlitri, preparare prima il cloridrato di Tris da 10 millimolare a pH 7,5 contenente cloruro di potassio da 50 millimolare, DTT millimolare, albumina del siero bovino da 09 microgrammi per microlitro, RNAsin da 5 unità per microlitro, tRNA da 15 microgrammi per microlitro e EDTA millimolare. Quindi aggiungere 30 microlitri di proteina ricombinante PTB e 10 microlitri di RNA dalla piscina appropriata. Posizionare i tubi contenenti le reazioni di legame in un blocco di temperatura per circa 30 minuti a 25 gradi Celsius.
Successivamente, frazionare l'RNA legato dall'RNA non associato attraverso quattro cicli di selezione e amplificazione. In primo luogo, filtrare il campione di 100 microliter a temperatura ambiente attraverso un filtro nitrocellulosa collegato a un collettore sottovuoto. Il complesso RNA-proteina rimane sul filtro.
Con una lama sterile, tritare il filtro in frammenti e inserirli in un tubo di centrifuga. Immergere i pezzi del filtro nel tampone proteinasi K e posizionarlo su un bicchiere per un minimo di tre ore o durante la notte per recuperare l'RNA. Per deproteinizzare il campione di RNA, aggiungere un volume uguale di fenolo-cloroformio, vortice e quindi centrifugare ad alta velocità per cinque minuti a temperatura ambiente.
Ottenere la fase acquosa ed estrarre nuovamente con cloroformio. Successivamente, mescolare il supernatante con 1/10 volume di acetato di sodio trimolare a pH 5.2 e da due a tre volumi di etanolo assoluto. Lasciare il tubo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti, quindi centrifugarlo ad alta velocità per 10 minuti.
Ripetere i passaggi di lavaggio e asciugatura con il 70% di etanolo e solubilizzare l'RNA in acqua trattata con DEPC. Dopo il primo round di test di legatura del filtro, eseguire altri tre round. Successivamente, eseguire due cicli di trascrizione, rilegatura e amplificazione per separare le frazioni di RNA legate alle proteine dalle frazioni non associate.
Prefabbricare un gel nativo del 5% di poliacrilammide con rapporto acrilammide-bis-acrilammide 60 a uno in tampone TBE 5x. Quindi impostare la reazione di legame RNA-proteina. Posizionare il gel in un dispositivo di elettroforesi riempito con tampone TBE 5x in una cella frigorifeca a quattro gradi Celsius.
Applicare 250 volt per 15 minuti e pipettare la reazione di legame in diversi pozzi. Quindi frazionare ulteriormente l'RNA legato dall'RNA non legato eseguendo l'elettroforesi a 250 volt per una o due ore. Successivamente, esporre il gel a una pellicola a raggi X e identificare la posizione dell'RNA legato usando l'autorazione.
Ritagliare la fetta di gel con l'RNA rilegato e inserirla in un tubo. Schiacciare la fetta di gel e incubare nel tampone di proteinasi K per tre ore o durante la notte. Ripetere l'estrazione con fenolo-cloroformio e cloroformio come descritto in precedenza.
Sintetizzare cDNA dall'RNA disciolto. Preparare 20 microlitri di reazione, tra cui due microlitri di tampone RT 10x, due microlitri di trascrittasi inversa AMV, un microlitro di primer inverso, cinque microlitri di acqua e 10 microlitri dell'RNA disciolto. Incubare a 42 gradi Celsius per 60 minuti.
Amplificare il cDNA utilizzando da 20 a 25 cicli PCR come descritto in precedenza. Ripetere il processo di sintesi dell'RNA, legame proteico e separazione delle frazioni legate alle proteine e non legate. Per analizzare il legame proteico, utilizzare il saggio di spostamento della mobilità del gel o il saggio di legame del filtro per determinare l'affinità e la specificità di legame per pool selezionati o sequenze individuali all'interno di ogni pool.
Utilizzare l'autoraitografia o un imager fosforico per rilevare e quantificare le bande nella frazione associata e nella frazione non associata. Continuare il protocollo con la clonazione e l'allineamento della sequenza. In questo studio è stata raggiunta una selezione-amplificazione di successo.
La proteina legante del tratto polipirimidina dei mammiferi con una concentrazione proteica 300 volte superiore mostra un legame appena rilevabile con la sequenza zero della piscina ma un'alta affinità per il pool di sequenze selezionato. Selezione-amplificazione identificata con successo su proteine leganti RNA con sito di legame preferito o consensuale. L'aggiunta del PTB ricombinante, che si lega a un sito di giunzione a tre numeri primi a monte, porta all'attivazione del sito alternativo o a valle della giunzione a tre primi.
Al contrario, l'aggiunta di hnRNP C ricombinante porta alla repressione di entrambi i siti di giunzione a tre numeri primi. L'aggiunta del fattore di giunzione generale ricombinante U2AF65 ha invertito la repressione del sito di giunzione a tre numeri primi mediata da HNRNP C. È importante ricordare che una buona libreria randomizzata e condizioni di legame adeguate che danno un arricchimento ad alta piega in ogni fase di rilegatura sono necessarie per il successo.
Per convalidare l'esito di questo approccio possono essere utilizzati saggi funzionali adeguati e prove in vivo. Nel campo dell'espressione genica, le funzioni di numerose proteine sono state studiate usando questa tecnica. È importante utilizzare guanti e guarnizioni radioattive per la protezione mentre si lavora con poliacrilammide e radioattività.
