Gli autori ringraziano tutti i membri dei laboratori Ule, Luscombe e Zupan di discussione e di assistenza sperimentale. Ringraziamo James Hadfield e Nik Matthews per high-throughput sequencing. Vorremmo far notare che il metodo descritto qui iClip parti diverse fasi con il protocollo clip originale, sviluppato da Kirk Jensen e JU nel laboratorio di Robert Darnell. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca concedere 206726-CLIP per JU e una a lungo termine Scienze Umane Frontiers borsa di studio del programma a JK

1. UV cross-linking di coltura dei tessuti delle cellule <ol><li> Rimuovere il supporto e aggiungere 6 ml ghiacciata PBS alle cellule coltivate in un piatto di 10 cm (sufficiente per tre esperimenti). </li><li> Togliere il coperchio e posizionare sul ghiaccio. Irradiare una volta con 150 mJ / cm 2 a 254 nm. </li><li> Raccogliere le cellule raschiando con un sollevatore di cellulare. </li><li> Trasferire 2 ml di sospensione cellulare a ciascuna delle tre microtubi. Girare alla massima velocità per 10 secondi a 4 ° C per le cellule pellet, quindi rimuovere il surnatante. </li><li> Snap-congelare il pellet cellulare in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Tallone preparazione <ol><li> Aggiungere 100 ml di proteina A Dynabeads (Dynal, 100,02) per sperimentare un microtubo fresco (Usa Dynabeads proteina G per un mouse o anticorpi di capra). </li><li> Lavare perline 2x con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; deossicolato di sodio allo 0,5%, 1 / 100 della proteasi cocktail III, Calbiochem). </li><li> Risospendere le sfere in 100 microlitri tampone di lisi con 2-10 mg di anticorpi. </li><li> Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 30-60 min. </li><li> Lavare 3x con 900 microlitri tampone di lisi e lasciare in ultimo lavaggio fino al momento di passare al punto 4.1. </li></ol> 3. Lisi cellulare e parziale digestione dell&#39;RNA <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi e il trasferimento a 1,5 microprovette ml. </li><li> Preparare un 1 / 500 di diluizione di RNasi I (Ambion, AM2295). Aggiungere 10 microlitri RNasi di diluizione e 2 microlitri DNasi Turbo al lisato cellulare (1 / 500 RNase diluizioni I [bassa RNAsi] sono utilizzati per la preparazione della biblioteca; 1 / 50 diluizioni [alta RNAsi] sono indispensabili per controllare per specificità anticorpale) . </li><li> Incubare i campioni per esattamente 3 minuti a 37 ° C, agitando a 1.100 giri al minuto. Trasferire immediatamente in ghiaccio. </li><li> Spin a 4 ° C e 22.000 g per 20 minuti per eliminare il lisato. Raccogliere accuratamente il sopranatante (lasciare circa 50 microlitri lisato con il pellet). </li></ol> 4. Immunoprecipitazione <ol><li> Rimuovere il tampone di lavaggio dai grani (dal punto 2.5), quindi aggiungere il lisato cellulare (dal punto 3.4). </li><li> Ruotare i campioni per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatante e lavare le perle di 2x con 900 microlitri di alto sale del buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 M di NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS; deossicolato 0,5% di sodio). </li><li> Lavare 2x con 900 microlitri di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0.2% Tween-20). </li></ol> 5. Defosforilazione di 3&#39;ends RNA <ol><li> Eliminare il supernatante e risospendere il mix di perle in 20 microlitri PNK (15 microlitri di acqua, 4 microlitri pH 5x PNK 6,5 buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2]; enzima 0,5 microlitri PNK; 0,5 microlitri RNasin [Promega]). </li><li> Incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer lavarsi e lavare 1x con alto contenuto di sale buffer. </li><li> Lavare 2x con tampone di lavaggio. </li></ol> 6. Legatura linker per RNA 3 &#39; <ol><li> Rimuovere con attenzione il sopranatante e risospendere il mix di perle in 20 microlitri legatura (9 microlitri di acqua, 4 microlitri di buffer legatura 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 ditiotreitolo mm]; 1 ml di RNA ligasi [NEB]; RNasin 0,5 microlitri [Promega]; 1,5 microlitri di pre-adenylated linker L3 [20 mM], 4 microlitri PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Incubare per una notte a 16 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio e poi lavare 2x con 1 ml di alto sale buffer. </li><li> Lavare 2x con 1 ml di tampone di lavaggio e lasciare in 1 ml di secondo lavaggio. </li></ol> 7. Fine RNA 5 &#39;etichettatura <ol><li> Rimuovere il supernatante e risospendere le sfere in 8 ml di caldo mix PNK (0,4 microlitri PNK [NEB]; 0,8 microlitri 32 P-γ-ATP; 0,8 microlitri di buffer 10x PNK [NEB]; 6 acqua microlitri). </li><li> Incubare per 5 min a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il mix caldo PNK e risospendere le sfere in 20 l tampone di caricamento Nupage 1x (Invitrogen). </li><li> Incubare su un Thermomixer a 70 ° C per 10 min. </li><li> Immediatamente sul posto un magnete per far precipitare le perline vuoto e caricare il surnatante sul gel (vedi punto 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE e trasferimento a membrana <ol><li> Caricare i campioni su un NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Utilizzate da 0,5 l di 1x tampone MOPS esecuzione (Invitrogen). Anche carico 5 ml di un pre-macchiato marcatore proteico dimensioni (ad esempio PAGE righello plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Esegui il gel per 50 min a 180 V. </li><li> Rimuovere la parte anteriore gel ed eliminare i rifiuti solidi (contiene libero radioattivi ATP). </li><li> Trasferire la proteina-RNA complessi dal gel ad una membrana di nitrocellulosa con l&#39;apparecchiatura di trasferimento Novex umido secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen, trasferire 1 ora a 30 V). </li><li> Dopo il trasferimento, lavare la membrana in un tampone PBS, poi avvolgetelo nella pellicola trasparente e di esporla a una pellicola Fuji a -80 ° C (posto un adesivo fluorescente accanto alla membrana per allineare in seguito tche film e la membrana; eseguire esposizioni per 30 minuti, 1 ora e durante la notte). </li></ol> 9. RNA isolamento <ol><li> Isolare la proteina-RNA complessi dal basso RNasi esperimento utilizzando il autoradiograph dal punto 8.5 come una maschera. Tagliare questo pezzo di membrana in diverse fettine e metterli in un microtubo 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di buffer PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) e 10 microlitri proteinasi K (Roche, 03115828001) ai pezzi membrana. Incubare agitando a 1.100 rpm per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 200 ml di PKurea tampone (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M urea) e incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Raccogliere la soluzione e aggiungere insieme con 400 ml di fenolo / cloroformio (Ambion, 9722) in una fase 2 ml di tubo di blocco Gel pesanti (713-2536, VWR) RNA. </li><li> Incubare per 5 minuti a 30 ° C, agitando a 1.100 giri al minuto. Separare le fasi di filatura per 5 min a 13.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo (attenzione a non toccare il gel con la pipetta). Aggiungere 0,5 microlitri glycoblue (Ambion, 9510) e 40 microlitri 3 M di sodio acetato pH 5.5 e mescolare. Poi aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 10. Trascrizione inversa <ol><li> Spin per 20 minuti a 15.000 rpm e 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 0,5 ml di etanolo al 80%. </li><li> Risospendere il precipitato in 7,25 microlitri di RNA / Primer Mix (6,25 microlitri di acqua, 0,5 fondo Rclip microlitri [0.5pmol/μl]; 0,5 microlitri dNTP mix [10 mM]). Per ogni esperimento o replicare, utilizzare un primer diverso Rclip contenenti sequenze di codici a barre individuale (v. 14). </li><li> Incubare per 5 minuti a 70 ° C prima di raffreddamento a 25 ° C. </li><li> Aggiungi 2,75 microlitri RT mix (2 microlitri di buffer 5x RT; 0,5 microlitri 0.1M DTT; 0,25 microlitri Apice III della trascrittasi inversa [Invitrogen]). </li><li> Incubare 5 minuti a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C prima di raffreddamento a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 90 microlitri di buffer TE, 0,5 microlitri glycoblue e 10 microlitri acetato di sodio pH 5.5 e mescolare. Poi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 11. Gel purificazione di cDNA <ol><li> Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 6 ml di acqua. </li><li> Aggiungere 6 microlitri 2x TBE-urea tampone di caricamento (Invitrogen). Campioni di calore a 80 ° C per 3 minuti prima di caricare direttamente. </li><li> Caricare i campioni su un 6% prefabbricato TBE-urea gel (Invitrogen) e correre per 40 min a 180 V, come descritto dal produttore. Anche caricare un marker a basso peso molecolare per il taglio successivi (vedi sotto). </li><li> Tagliare tre bande a 120-200 nt (alto), 85-120 nt (media) e 70-85 nt (basso). Usa theupper colorante ei segni sul supporto in plastica gel per guidare l&#39;escissione (vedi figura 3). Si noti che il primer Rclip e la sequenza L3 insieme rappresentano il 52 nt della sequenza CLIP. </li><li> Aggiungere 400 microlitri TE e schiacciare la fetta gel in piccoli pezzi con una siringa da 1 ml stantuffo. Incubare agitando a 1.100 giri al minuto per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Inserire due 1 centimetro di vetro pre-filtro (Whatman, 1.823.010), in una colonna Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Trasferire la parte liquida del campione alla colonna. Spin per 1 minuto a 13.000 giri al minuto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri glycoblue e 40 microlitri di acetato di sodio pH 5.5, poi mescolare il campione. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 12. Legatura di primer per la 5&#39;end del cDNA <ol><li> Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 8 mix legatura microlitri (6,5 microlitri di acqua; 0,8 microlitri 10x CircLigase Buffer II; 0,4 microlitri 50 mM MnCl 2; 0,3 microlitri; Circligase II [Epicentre]) e incubare per 1 ora a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 30 microlitri mix di oligo ricottura (26 microlitri di acqua, 3 Buffer FastDigest microlitri [Fermentas]; 1 ml cut_oligo [10 mM]). Incubare per 1 minuto a 95 ° C. Poi diminuire la temperatura ogni 20 sec di 1 ° C fino a 25 ° C si raggiungono. </li><li> Aggiungere 2 microlitri BamHI (Fast Fermentas) e incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 50 microlitri TE e 0,5 microlitri glycoblue e mescolare. Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio pH 5.5 e mescolare, poi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%. Mescolare di nuovo e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 13. Amplificazione PCR <ol><li> Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 19 microlitri di acqua. </li><li> Preparare la miscela di PCR (19 microlitri cDNA; 1 ml fondo mix P5/P3 Solexa, 10 mM ciascuno, 20 microlitri Accuprime Supermix 1 enzima [Invitrogen]). </li><li> Eseguire il seguente programma di PCR: 94 ° C per 2 minuti, [94 ° C per 15 sec, 65 ° C per 30 secondi, 68 ° C per 30 sec] 25-35 cicli, 68 ° C per 3 minuti, 4 ° C per sempre. </li><li> Mix 8 microlitri prodotto di PCR con 2 ml di tampone 5x carico TBE e caricare su un 6% gel prefabbricati TBE (invitRogen). Macchiare il gel con Sybrgreen I (Invitrogen) e analizzare con un imager gel. </li><li> Il codice a barre nella primer Rclip permettono ai campioni di diversi multiplex prima della presentazione per il sequenziamento throughput elevato. 15 ml di presentare la biblioteca per il sequenziamento e conservare il resto. </li></ol> 14. Linker e primer sequenze DNA linker pre-adenylated 3 &#39;: [Ordiniamo l&#39;adattatore DNA da IDT e poi fare aliquote di 20μM.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" /> 15. Rappresentante dei risultati: Prima del sequenziamento della biblioteca iClip, il successo di questo esperimento può essere monitorato in due fasi: la autoradiograph della proteina-RNA complesso dopo il trasferimento a membrana (passo 8.5) e l&#39;immagine gel dei prodotti di PCR (passo 13,4). Nel autoradiograph del basso-RNasi campioni, la radioattività diffusa deve essere vista al di sopra del peso molecolare della proteina (Figura 2, campione 4). Per l&#39;alta RNAsi campioni, questa radioattività è focalizzata più vicino al peso molecolare della proteina (Figura 2, campione 3). Quando non viene utilizzato anticorpi nel immunoprecipitazione, nessun segnale deve essere rilevato (Figura 2, i campioni 1 e 2). Ulteriori controlli importante per la specificità del immunoprecipitazione omettere irradiazione UV o cellule uso che non esprimono la proteina di interesse 14. L&#39;immagine gel dei prodotti di PCR (passo 13,4) dovrebbe mostrare un intervallo di grandezza che corrisponde alla frazione cDNA (alta, media o bassa) purificata nel passo 11,4 (Figura 4, corsie 4-6). Si noti che la PCR primer P3Solexa e P5Solexa introdurre un ulteriore 76 nt alla dimensione del cDNA. Se nessun anticorpo è utilizzato durante la immunoprecipitazione, nessun prodotto corrispondente PCR dovrebbe essere rilevato (Figura 4, corsie 1-3). Dimero prodotto primer può apparire a circa 140 nt. Per i risultati rappresentativi di high-throughput sequencing e la successiva analisi bioinformatica vedere 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo iClip. Proteina-RNA sono complessi covalentemente reticolato in vivo, utilizzando radiazioni UV (fase 1). La proteina di interesse è purificata con l&#39;RNA legato (passi 2-5). Per consentire la sequenza-specifica adescamento di trascrizione inversa, un adattatore RNA è legatura al 3 &#39;del RNA, mentre il 5&#39; è radioattivo (punti 6 e 7). Reticolato proteina-RNA complessi sono purificati da RNA gratuitamente utilizzando SDS-PAGE e trasferimento a membrana (punto 8). L&#39;RNA è recuperato dalla membrana da digerire le proteine ​​con proteinasi K lasciando un polipeptide rimane alla cross-link nucleotide (punto 9). Trascrizione inversa (RT) tronca il polipeptide rimanente e introduce due regioni adattatore cleavable e sequenze di codici a barre (punto 10). Selezione del formato rimuove senza fondo RT prima circularization. La linearizzazione segue genera modelli adatti per l&#39;amplificazione PCR (passi 11-15). Infine, high-throughput sequencing genera legge in cui le sequenze di codici a barre sono immediatamente seguite da nucleotide ultimo dei cDNA (passo 16). Dal momento che questo nucleotide individua una posizione a monte del reticolato nucleotide, il sito di legame si può dedurre con alta risoluzione. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Autoradiograph di cross-linked hnRNP C-RNA complessi mediante elettroforesi su gel di denaturazione e trasferimento di membrana. hnRNP C-RNA sono stati complessi immuno-purificato da estratti cellulari utilizzando un anticorpo contro hnRNP C (α hnRNP C, campioni 3 e 4). RNA è stato parzialmente digerito con bassa (+) o alto (+ +) concentrazione di RNAsi. Complessi spostando verso l&#39;alto dalla dimensione della proteina (40 kDa) possono essere osservati (campione 4). Il cambiamento è meno pronunciato quando alte concentrazioni di RNasi sono stati utilizzati (esempio 3). Il segnale radioattivo scompare quando non anticorpale è stato utilizzato nel immunoprecipitazione (campioni 1 e 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Schematica 6% TBE-urea gel (Invitrogen) per guidare l&#39;escissione di prodotti iClip cDNA. Il gel viene eseguito per 40 minuti a 180 V che porta ad un modello migratorio riproducibile di cDNA e coloranti (chiaro e blu scuro) nel gel. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare (linea rossa) l&#39;alto (H), medio (M) e bassa (L) frazioni cDNA. Iniziate tagliando a metà del colorante azzurro e immediatamente sopra il marchio sulla cassetta gel di plastica. Dividere le frazioni di media e bassa e tagliare la frazione alta circa 1 cm sopra il colorante azzurro. Usa tagli verticali guidati dalla tasche e il colorante per separare le corsie diverse (in questo esempio 1-4). Il vicolo marcatore (m) può essere colorate e ripreso il controllodimensioni dopo il taglio. Dimensioni frammento sono indicati sulla destra. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. L&#39;analisi di PCR-amplificato librerie iClip cDNA usando elettroforesi su gel. RNA recuperato dalla membrana (figura 1) è stata trascrizione inversa e la dimensione-purificati mediante elettroforesi su gel denaturante (Figura 2). Tre frazioni dimensione del cDNA (alta [H]: 120-200 nt, media [M]: 85-120 nt e bassa [L]: 70-85 nt) sono stati recuperati, circularized, ri-linearizzata e PCR-amplificato. I prodotti di PCR di distribuzione di diverse dimensioni si possono osservare a seguito di diverse dimensioni delle frazioni di ingresso. Dal momento che il primer PCR presenta 76 nt al cDNA, le dimensioni deve essere compresa tra 196-276 nt per alta, nt 161-196 per le medie e 146-161 nt per le frazioni bassa dimensione. I prodotti di PCR sono assenti quando non anticorpale è stato utilizzato per l&#39;immunoprecipitazione (corsie 1-3).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dato che il protocollo iClip contiene una vasta gamma di reazioni enzimatiche e fasi di purificazione, non è sempre facile identificare un problema quando un esperimento fallisce. Al fine di controllo per la specificità della RNA identificato cross-link siti, uno o più controlli negativi devono essere mantenuti per tutto l&#39;esperimento completo e la successiva analisi computazionale. Questi controlli possono essere il non-anticorpo del campione, la non cross-linked cellule, o immunoprecipitazione da cellule knockout o tessuto. Idealmente, questi esperimenti di controllo non dovrebbe purificare ogni proteina-RNA complessi, e quindi dovrebbe dare nessun segnale sul gel SDS-PAGE, e nessun prodotto rilevabile dopo amplificazione PCR. High-throughput sequencing di queste librerie di controllo dovrebbe restituire sequenze uniche pochissime. Knockdown cellule non sono raccomandati come controllo di sequenziamento, dal momento che le sequenze risultanti sempre conforme ai cross-link siti della stessa proteina, che è purificato dalle cellule atterramento in piccole quantità. Precauzioni devono essere adottate per evitare la contaminazione con prodotti di PCR di precedenti esperimenti. Il modo migliore per minimizzare questo problema è quello di separare spazialmente fasi pre-e post-PCR. Idealmente, l&#39;analisi dei prodotti di PCR e tutti i passi successivi devono essere eseguite in una stanza separata. Inoltre, ogni membro del laboratorio deve utilizzare il proprio set di buffer e altri reagenti. In questo modo, le fonti di contaminazione possono essere più facilmente identificati.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Per elettroforesi su gel e il trasferimento della membrana si raccomanda l&#39;uso di t ha XCell SureLock ® Mini-Cell e XCell II ™ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), che è compatibile con l&#39;uso dei prefabbricati minigels differenti che sono specificati in tutto il protocollo . Il numero del marchio e l&#39;ordine di tutti i materiali utilizzati è menzionato durante il protocollo. L&#39;elenco degli enzimi utilizzati nel protocollo è riportato nella tabella sottostante. <table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Proteina A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> utilizzare G proteine ​​per gli anticorpi del mouse o di capra </td></tr><tr><td> I RNasi </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> attività può cambiare da lotto a lotto </td></tr><tr><td> T4 RNA ligasi I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinasi K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Apice III della trascrittasi inversa </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ Supermix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> questo mix PCR dà i risultati migliori nelle nostre mani </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

L&#39;esclusiva composizione e la disposizione spaziale di RNA-binding proteins (RBPs) su una trascrizione guida i diversi aspetti della regolazione post-trascrizionale 1. Quindi, un passo essenziale verso la comprensione regolamento trascrizione a livello molecolare è quello di ottenere informazioni sulla posizione i siti di legame del RBPs 2. Le interazioni proteina-RNA può essere studiato con metodi biochimici, ma questi approcci non affrontano l&#39;RNA vincolante nel suo contesto nativo cellulare. I tentativi iniziali per lo studio delle proteine-RNA complessi nel loro ambiente cellulare impiegata purificazione di affinità o di immunoprecipitazione in combinazione con display differenziale o analisi microarray (RIP-CHIP) 3-5. Questi approcci sono stati inclini a identificare le interazioni indiretti o non fisiologica 6. Al fine di aumentare la specificità e la risoluzione di posizione, una strategia denominata CLIP (UV cross-linking e immunoprecipitazione) è stato introdotto 7,8. CLIP combina UV cross-linking delle proteine ​​e molecole di RNA con sistemi di purificazione rigorosa tra cui gel elettroforesi di poliacrilammide denaturante. In combinazione con tecnologie high-throughput sequencing, CLIP ha dimostrato come un potente strumento per studiare le interazioni proteina-RNA su un genoma scala (indicato come HITS-CLIP e CLIP-ss) 9,10. Recentemente, PAR-clip è stato introdotto che utilizza analoghi ribonucleosidi fotoreattivo per il cross-linking 11,12. Nonostante l&#39;alta specificità dei dati ottenuti, gli esperimenti CLIP spesso generare librerie cDNA di complessità sequenza limitata. Ciò è in parte a causa della quantità limitata di co-purificato l&#39;RNA e le due inefficiente reazioni legatura RNA necessari per la preparazione della biblioteca. Inoltre, le analisi primer extension indicato che molti cDNA troncare prematuramente al reticolato 13 nucleotidi. Tali cDNA troncato vengono persi durante la preparazione del protocollo standard della libreria CLIP. Abbiamo recentemente sviluppato iClip (individuo-nucleotide CLIP risoluzione), che cattura il cDNA troncato sostituendo uno dei inefficiente intermolecolari passi legatura RNA con una più efficiente circularization intramolecolari cDNA (Figura 1) 14. È importante sottolineare che il sequenziamento del cDNA troncato fornisce intuizioni sulla posizione del cross-link del sito ad una risoluzione nucleotide. Abbiamo applicato con successo allo studio iClip hnRNP organizzazione delle particelle C su un genoma scala e valutare il suo ruolo nella regolazione di splicing 14.

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iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

La disposizione spaziale di RNA-binding proteins in una trascrizione è un fattore determinante di regolazione post-trascrizionale. Pertanto, abbiamo sviluppato i singoli nucleotide reticolazione UV risoluzione e immunoprecipitazione (iClip) che permette preciso genoma mappatura dei siti di legame di una RNA-binding protein.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

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58.1K Views.  Medical Research Council - MRC. La disposizione spaziale di RNA-binding proteins in una trascrizione è un fattore determinante di regolazione post-trascrizionale. Pertanto, abbiamo sviluppato i singoli nucleotide reticolazione UV risoluzione e immunoprecipitazione (iClip) che permette preciso genoma mappatura dei siti di legame di una RNA-binding protein.

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Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Non invasive di visualizzazione 3D con sub-micron Risoluzione Utilizzando sincrotrone a raggi-X, la tomografia

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Ricerca

Biologia

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Mappatura delle postumi di Theta Burst stimolazione sulla corteccia uditiva umana con imaging funzionale

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genome-wide Mappatura delle interazioni proteina-DNA da High Throughput Sequencing di Adenina-metilato frammenti di DNA

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.