Ringraziamo il Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin per la loro consigli utili nella creazione del protocollo di rapida e fornire i plasmidi necessari. Ringraziamo anche il Dott Avigail Atir-Lande per il suo aiuto nella creazione di questo protocollo e il dottor Tamar Ziv dalla Smoler Proteomica Centro per il suo aiuto con l&#39;analisi LC-MS / MS. Ringraziamo il Prof. TG Kinzy (Rutgers) per l&#39;anticorpo YEF3. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione 2.011.013 dalla Science Foundation binazionale.

Nota: inserire una sequenza composta da 12 siti MS2-assorbente (MS2 loop; MS2L) nel locus genomico desiderato, di solito tra la griglia di lettura aperta (ORF) e il 3 &#39;UTR. Un protocollo dettagliato per questa integrazione è fornito altrove 22. Verificare il corretto inserimento e di espressione mediante PCR, analisi Northern o RT-PCR 20,23. È importante verificare che l&#39;integrazione non è intervenuto con la sintesi del 3&#39;UTR. Inoltre, un plasmide esprimente MS2-CP fuso SBP sotto l&#39;espressione di un promotore inducibile (esaurimento metionina) dovrebbe essere introdotto nelle cellule 24. Un ceppo identico, escluse le anse MS12 introdotte, dovrebbe essere usato come un controllo per il rilevamento di segnali non specifici. 1. purificazione rapida <ol><li> Grow 500 ml di cellule di lievito (usare 250-1,000 ml di cellule di lievito a seconda del livello di espressione del gene di interesse) esprimenti MS2-etichettato mRNA 20 eMS2-CP-GFP-SBP proteina di fusione da 24 a 600 OD 0,8-1,0 a 30 ° C in terreno di coltura appropriato (ad esempio, sintetico destrosio (SD) terreno selettivo). </li><li> cellule centrifugare a 3000 xg per 4 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule in 1x tampone fosfato (PBS), centrifuga come prima (passo 1,2), risospendere in un volume uguale (passo 1.1) di SD senza metionina, e incubare per 45 - 60 minuti a 30 ° C per indurre l&#39;espressione del MS2 -CP-GFP-SBP proteina di fusione. Nota: tempo di induzione più lungo può causare aggregazione di GFP. </li><li> Mettere da parte 10 ml di cellule e di estrarre l&#39;RNA da questo campione con il metodo semplice &quot;fenolo caldo&quot; 25. Attenzione: fenolo è altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. Nota: Questo RNA è un buon riferimento per la qualità dell&#39;RNA isolato (Figura 1A). </li><li> Per 500 ml cellule, aggiungere 1,35 ml 37% di formaldeide al c finaleoncentration del 0,1% per reticolare i complessi RNA-proteina. Continua incubazione a 30 ° C per 10 min. Attenzione: La formaldeide è altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. </li><li> Aggiungere 26,5 ml di 2,5 M glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M e incubare per 3 minuti per fermare reticolazione. Da questo punto in poi, mettere tutto in ghiaccio per ridurre al minimo la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Cellule centrifugare a 3000 xg per 4 minuti a 4 ° C e lavare con 45 ml di freddo 1x PBS. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml rapida lisi tampone per 100 ml di coltura cellulare iniziali. </li><li> Suddiviso in aliquote di 500 microlitri in tubi microcentrifuga con tappo a vite e aggiungere ~ 400 mg di perle di vetro refrigerate a ciascuna aliquota (circa un pieno 0,2 ml provetta PCR). </li><li> Lisare le cellule in una perlina battitore per 3 min. Subito mettere il lisato in ghiaccio. Nota: La lisi cellulare rilasci RNasi cellulari, che sono la principale causa di degradazione dell&#39;RNA. tampone rapida lisi contiene un&#39;alta concentrazione di RNAsi INHIcura dell&#39;Espositore, quali l&#39;eparina non specifico inibitore RNasi e inibitori specifici. Si raccomanda anche di lavoro rapidamente e tenere tutto freddo. </li><li> Trasferire il lisato di nuovi tubi. Pierce un piccolo foro nella parte inferiore di ciascuna provetta da microcentrifuga con un ago caldo (0,8 mm x 40 mm) e posizionare i tubi microcentrifuga sopra dei tubi 15 ml. Utilizzare la testa di una siringa da 5 ml da adattatore fra i tubi microcentrifuga e le provette da 15 ml. Centrifugare il gruppo tubi a 3.000 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire il flow-through dal tubo 15 ml in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per eliminare i detriti cellulari. </li><li> surnatanti piscina da tutte le provette da 1,5 ml in un unico tubo da 15 ml, e mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato per l&#39;RNA e l&#39;isolamento delle proteine, rispettivamente. Nota: Questi serviranno da campioni &quot;input&quot; per successiva analisi (Figura 1). </li><li> Aggiungere 300 mg di avidina per 500 ml di icoltura di lieviti nitial e incubare per 30 min (questo può essere ridotto a 10 min) a 4 ° C sotto laminazione costante (10 rpm). Nota: i blocchi avidina biotina e proteine ​​biotinilati di legarsi ai talloni streptavidina. </li><li> Pre-lavare le perline streptavidina prima dell&#39;incubazione con lisato cellulare. <ol><li> Trasferire circa 300 ml di streptavidina perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere il surnatante superiore. Questo si tradurrà in 250 pl di perline. Lavare le perle due volte con 1 ml di tampone di lisi RaPID. Centrifugare le perline streptavidina a 660 xg per 2 minuti a 4 ° C tra ogni passo. </li><li> Bloccare le perle incubando per 1 ora con 0,5 ml di tampone di lisi RaPID, 0,5 ml di 10 mg / ml BSA e 10 ml di 10 mg / ml tRNA lievito. Beads possono essere lasciati O / N in soluzione bloccante a 4 ° C con rotazione se necessario. </li><li> Lavare due volte con 1 ml di rapida lisi buffer. Nota: perline magnetici possono essere utilizzati anche per ridurre i tempi e Prioritàound. Questi, tuttavia, avere una capacità inferiore a perline sefarosio. </li></ol></li><li> Aggiungere 250 pl di perline streptavidina pre-lavati al lisato avidina contenente (dal punto 1.14) e incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione costante (10 rpm). Nota: Questo tempo di incubazione è un compromesso tra fornire tempo sufficiente vincolante e riducendo al minimo le possibilità per la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Centrifugare a 660 xg per 2 minuti a 4 ° C per cancellare le perline streptavidina e trasferire il surnatante in un nuovo tubo 15 ml. Mettere da parte 1/50 e 1/100 volume del lisato per RNA e proteine ​​isolamento, rispettivamente. Nota: Questi saranno i campioni &quot;Unbound&quot;. </li><li> Lavare le perline con 1 ml di tampone rapida lisi, agitare delicatamente, trasferire in una nuova provetta da 1,5 ml, e centrifugare come al punto 1.17. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Lavare le perline con 1 ml di tampone Rapid Wash, e questa volta la rotazione (10 rpm) per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere questa operazione due volte. </li&gt; <li> Lavare le perline con 1 ml di PBS 1x e centrifugare come sopra. </li><li> Lavare le perline di nuovo con 120 ml di PBS 1x. Centrifuga come sopra, e prendere l&#39;intero surnatante per l&#39;RNA e l&#39;estrazione di proteine ​​come il campione &quot;Wash&quot;. Nota: Questo ultimo campione di lavaggio indicherà la severità dei lavaggi e dovrebbe essere dello stesso volume del campione di eluizione. Questo semplificherà trasformazione e caricamento in saggi successivi. </li><li> Per eluire RNA e proteine ​​RNA associate dalla colonna, aggiungere 120 ml di 6 mM biotina in 1x PBS e incubare per 45 min a 4 ° C con rotazione costante (10 rpm). </li><li> Centrifugare le perline come sopra e trasferire il materiale eluito in una nuova provetta da 1,5 ml. Spin nuovamente il campione eluito e trasferire la fase superiore in una nuova provetta da 1,5 ml per garantire che non riporto di perline. </li><li> Prelevare campioni per RNA o estrazione di proteine. Nota: Il volume taken dovrebbe dipendere dal seguente livello di dosaggio ed espressione del RNA o proteina di interesse. Come linea guida, per l&#39;analisi del nord 26, prendere l&#39;80% del campione, per il Western Blot 23,27 o RT-PCR 28, prendere il 20%, e per la spettrometria di massa 29 alla scoperta di nuove proteine, prendere l&#39;intero campione. </li></ol> 2. RNA Estrazione <ol><li> Aggiungere un volume uguale di 2x reticolazione Reversal Buffer e incubare per 45 min a 65 ° C. Continuare direttamente per estrazione di RNA. Nota: L&#39;inversione reticolazione tampone contiene acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), che migliora in modo significativo l&#39;estrazione di RNA 20. </li><li> Utilizzare il fenolo di serie: il metodo cloroformio 26 per estrarre l&#39;RNA dal &quot;ingresso&quot; e campioni &quot;non legati&quot; (passi 1.13 e 1.17). Nota: Questi campioni contengono una grande quantità di eparina inibitore RNasi, che può inibire successive Reverse Transcriptase- (RT) saggi che utilizzano (ad esempio, RT-PCR), di conseguenza, LiCl precipitazioni 30 si consiglia di rimuoverlo. Il &quot;wash &quot;e&quot; campioni di eluizione &quot;(passi 1.21 e 1.24) contengono piccole quantità di RNA e sono precipitati attraverso le seguenti fasi. </li><li> Aggiungere un volume uguale di 8M Guanidinium-HCl (GuHCl) e due volumi di etanolo 100% al &quot;lavaggio&quot; e &quot;campioni eluizione&quot;. Incubare a -80 ° C per almeno 2 ore. Nota: Guanidinium in modo efficiente denaturare le proteine ​​e quindi inibire RNasi e proteasi nel campione. </li><li> Centrifugare a 20.000 xg, a 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante. Lavare il pellet con fredda 80% etanolo e centrifugare nuovamente a 20.000 xg, a 4 ° C per 15 min. </li><li> Sciogliere il pellet di RNA in 400 ml di RNasi acqua libera e precipitare di nuovo per eliminare ogni residuo GuHCl o altri contaminanti. Aggiungere 40 ml di acetato di 3 M di sodio, pH 5,2 e 800 ml di etanolo al 100%, incubare a -20 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Centrifuga e lavare come al punto 2.4 e rimuovere tutti etanolo con una punta di 10 microlitri. Risospendere il pell RNAet in 10 microlitri acqua priva di RNasi. Fate particolare attenzione come il pellet di RNA di solito non è visibile. Nota: I campioni possono essere utilizzati per l&#39;analisi Northern come descritto in 23 (figura 1). </li></ol> 3. preparazione proteina per Western Blot o Analysis spettrometria di massa <ol><li> Aggiungere 1/3 volume di 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) per campioni di proteine ​​e incubare 45 min a 65 ° C per invertire la reticolazione di RNA e proteine. Nota: I campioni possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Proteine eseguito su un gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) 31. Regolare la percentuale del gel in base alle dimensioni delle proteine ​​da analizzare. Nota: gel di acrilammide 10% dà una vasta gamma di separazione ed è buono come prima approssimazione. </li><li> Trasferire proteine alla membrana come nell&#39;analisi immunoblot standard di 27 per il controllo dell&#39;efficienza di isolamento (Figura 1C). Macchia sia con Coomassie Blu R250 o argento macchia prima analisi di spettrometria di massa. Nota: macchia d&#39;argento è la scelta preferita perché è più sensibile e permette una migliore rilevazione (Figura 1B). La colorazione può essere fatto sia con soluzioni preparate manualmente o kit commerciali. Il tempo di incubazione del gel nella soluzione finale di colorante deve essere determinato sperimentalmente. incubazione può rivelare basse proteine ​​abbondanti, ma può causare proteine ​​altamente espresse, come MS2-CP-SBP-GFP essere finita macchiata e può mascherare le proteine ​​che circondano nelle loro vicinanze. Inoltre, si potrebbe verificare un fondo elevato. Seguire la reazione con cura, e aggiungere soluzione di arresto al momento opportuno. </li><li> Tagliare le bande dal gel e trasferirli in provette da 1,5 ml. Conservare i campioni a -20 ° C, o inviare per l&#39;estrazione di proteine e tripsina digestione seguita da analisi LC-MS / MS 32. </li><li> Come un approccio di proteomica alternativo per escludere la fase di separazione del gel, digerire materiale eluito dal punto 1.24 in modo daluzione utilizzando tripsina e oggetto di analisi LC-MS / MS 33. Nota: Omettere la separazione SDS-PAGE semplifica il protocollo e ne aumenta la resa. Tuttavia, i campioni possono contenere tracce di detergente NP-40, che inibisce l&#39;analisi di spettrometria di massa. Per superare questo problema, effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Eseguire proteine su SDS-PAGE 31 per 10 - 15 minuti. </li><li> Tagliare l&#39;intera porzione della corsia (cioè, dove si trovano le proteine). Nota: Il campione proteico potrebbe includere una quantità significativa della proteina MS2-CP-SBP che possono oscurare i segnali di proteine ​​poco abbondanti. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors declare no competing financial interests.

Vari metodi utilizzano l&#39;isolamento di mRNA specifici per identificare le loro proteine associate 11,34 35. Questi metodi si applicano in vitro e in vivo strategie per sondare le interazioni RNA-proteina. Metodi in vitro incubare esogena trascritti di RNA con lisato cellulare per catturare RBPs e isolare complessi RNP 36,37. Un approccio efficace di questo tipo è stato presentato di recente, che ha permesso l&#39;identificazione di nuove proteine che legan...

RNA-binding proteins (RBPs) rappresentano circa il 10% di S. proteine cerevisiae 1,2 e circa il 15% delle proteine di mammiferi 3-5. Essi sono implicati in molti processi cellulari, come l&#39;elaborazione di mRNA post-trascrizionale e la regolamentazione, la traduzione, biogenesi dei ribosomi, tRNA aminoacilazione e la modifica, il rimodellamento della cromatina, e altro ancora. Un importante sottogruppo di RBPs è proteine mRNA-binding (mRNPs) 6,7. Nel corso di mRNA maturazione diversi RBPs legano la trascrizione e mediare la sua lavorazione nucleare, l&#39;esportazione fuori dal nucleo, localizzazione cellulare, la traduzione e la degradazione 6-8. Così, la serie distinta di RBPs legati ad una particolare trascrizione in qualsiasi punto nel tempo determina la sua lavorazione e, infine, il suo destino. L&#39;identificazione di RBPs associati ad un mRNA potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione dei processi sottostanti la loro regolazione post-trascrizionale. Diverse genetica, Microscopiche metodi biochimici e bioinformatica sono stati utilizzati per identificare le proteine coinvolte nella regolazione di mRNA (rivisto in 9-11). Tuttavia, solo alcuni di questi metodi consentono l&#39;identificazione di proteine ​​associate con un particolare mRNA bersaglio. Da segnalare è l&#39;ibrido sistema di lievito Three (Y3H), che utilizza l&#39;mRNA di interesse come esca per lo screening di una libreria di espressione in cellule di lievito. Cloni positivi si osservano di solito attraverso una selezione di crescita o giornalista espressione 12-14. Il vantaggio principale di questo metodo è il gran numero di proteine ​​che possono essere scansionate in un ambiente cellulare e la capacità di misurare la forza dell&#39;interazione RNA-proteina. Svantaggi includono il numero relativamente elevato di falsi positivi a causa di legame non specifico, e l&#39;elevato potenziale di risultati falsi negativi dovuti, in parte, al ripiegamento della preda proteina di fusione o l&#39;RNA esca. Un&#39;alternativa all&#39;approccio genetico è purifi affinitàcazione di RNA con le sue proteine ​​associate. Poly A contenente mRNA può essere isolato mediante l&#39;uso di oligo dT colonne, e le loro proteine ​​associate vengono rilevati mediante spettrometria di massa. L&#39;interazione RNA-proteina è conservata nel suo contesto cellulare da reticolazione, che rende legami covalenti a corto raggio. L&#39;uso della colonna dT oligo produce una visione globale dell&#39;intero proteoma che è associato con qualsiasi poli A contenente mRNA 3,5,15. Tuttavia, questo non fornisce un elenco di proteine ​​che sono associati a un particolare mRNA. Molto pochi metodi sono disponibili per realizzare una tale identificazione. Il metodo COPPIA comporta la transfezione di acido nucleico con complementarità al bersaglio mRNA 16,17. L&#39;acido nucleico è anche collegato ad un peptide, che consente di reticolazione RBPs nelle immediate vicinanze del sito di interazione. Dopo la reticolazione, l&#39;acido RBP-peptide-nucleico può essere isolato e sottoposto ad analisi proteomica. Di recente, una metodologia basata su aptamero eraefficacemente applicato ad estratti da linee cellulari di mammiferi 18. Un aptamero RNA con una maggiore affinità con streptavidina è stato sviluppato e fusa ad una sequenza di interesse (elemento ricco di AU (ARE) in questo caso). Il aptameri-ARE RNA è stata allegata al perline streptavidina e mescolato con lisato cellulare. Le proteine ​​che associate con la sequenza ARE sono stati purificati e identificati mediante spettrometria di massa (MS). Anche se questo metodo rilevato associazioni che si verificano all&#39;esterno le impostazioni cellulari (cioè, in vitro), è probabile essere modificato in futuro in modo da introdurre aptameri nel genoma e consentire così l&#39;isolamento di proteine associate con il mRNA mentre nel ambiente cellulare (cioè, in vivo). In lievito, in cui le manipolazioni genetiche sono ben stabiliti, il metodo rapido (sviluppato nel laboratorio del Prof. Jeff Gerst) fornisce una visualizzazione di vivo associazioni in 19. RaPID combina la specifica e forte legame della proteina di rivestimento MS2 (MS2-CP) alla sequenza RNA MS2, e del dominio di legame streptavidina-(SBP) di streptavidina microsfere coniugate. In questo modo efficiente purificazione di mRNA MS2-taggate con perline streptavidina. Inoltre, l&#39;espressione di 12 copie MS2 loop consente fino a sei MS2-CP di impegnare contemporaneamente al RNA e aumentare l&#39;efficienza del suo isolamento. Questo protocollo è stato quindi suggerito di consentire l&#39;identificazione di nuove proteine ​​mRNA associate una volta che i campioni eluiti vengono sottoposti ad analisi proteomica mediante spettrometria di massa. Recentemente abbiamo utilizzato rapide per identificare nuovi proteine associate con il lievito PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA è stato precedentemente dimostrato di essere associato con la membrana ER e la sua regione 3 &#39;non tradotta (UTR) è stato trovato per essere un elemento determinante in questa associazione 21. Così, RBPs che legano PMP1 3 &#39;UTR sono suscettibili di svolgere un ruolo importante nella sua localizzazione. RaPID seguito da cromatografo liquidoy-spettrometria di massa / spettrometria di massa (LC-MS / MS) ha portato all&#39;identificazione di numerose nuove proteine che interagiscono con PMP1 20. Qui, forniamo un protocollo dettagliato della metodologia rapida e controlli importanti che devono essere fatte, e suggerimenti tecnici che possono migliorare il rendimento e la specificità.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &amp;micro;g/ml Leupeptin, 10 &amp;micro;g/ml Aprotinin, 10 &amp;micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &amp;micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&amp;nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0449</td><td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selective medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RaPID consente l&#39;isolamento di uno specifico RNA bersaglio con le sue proteine ​​associate. Critico per il successo è mantenere l&#39;RNA intatto il più possibile, ottenendo una quantità sufficiente di proteine. Per determinare l&#39;efficienza di isolamento e la qualità dell&#39;RNA, analisi Northern viene eseguita (Figura 1A). analisi Northern ha il vantaggio di segnalazione direttamente l&#39;efficienza e la qualità della RaPID. Così, le quantità relati...

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Views.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Ricerca

Biochimica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Genetica

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Riepilogo

Esplora Altri Video

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Metodo per l'isolamento e l'identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

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