J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander disegnano le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua e T. Putmon-Taylor eseguirono gli esperimenti. D. Chabot ha eseguito l'analisi dei dati. J. Chua scrisse il manoscritto.
Gli autori ringraziano Kyle J. Fitts per l'eccellente assistenza tecnica.
Il lavoro è stato supportato dalla concessione della Defense Threat Reduction Agency CBM. VAXBT.03.10.RD.015, piano numero 921175.
Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito degli Stati Uniti. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Difesa, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

In conformità con la legge sul benessere degli animali, la politica del servizio sanitario pubblico e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali, la ricerca qui descritta è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La struttura in cui è stata condotta questa ricerca è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio, internazionale e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche, 201124.
1. Coltura e manutenzione della linea cellulare, RAW 264.7
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite con tecniche asettiche.
<ol><li>Scaldare il siero bovino fetale (FBS) in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento. NOTA: Il tempo di inattivazione di 30 minuti inizia quando FBS raggiunge i 56 °C. Per monitorare la temperatura, riscaldare un volume simile di acqua in un becher nello stesso bagno d'acqua. Una volta che l'acqua raggiunge i 56 °C, inizia il conto alla rovescia di 30 minuti per FBS. In alternativa, FBS che è stato inattivato dal calore è anche disponibile in commercio.</li>
	<li>Preparare il mezzo per raw 264.7 cellule combinando il 90% di DMEM con glucosio alto e FBS inattivato al calore al 10% (v/v). Aggiungere L-glutammina ad una concentrazione finale di 6 mM. NOTA: DMEM con alto glucosio è formulato con 4 mM L-glutammina. L'integrazione della L-glutammina a 6 mM favorisce una crescita cellulare costante. 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina possono essere aggiunti per prevenire la contaminazione. Un'altra linea cellulare murina comune, J774A.1, può anche essere utilizzata ed è coltivata in condizioni simili.</li>
	<li>Scongelare una fiala congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 °C e rimuovere dal bagno non appena si scioglie. Aggiungere il contenuto aseticamente a un mezzo completo da 5 ml in un tubo conico. Invertire due volte il tubo conico e ruotare a 300 x g per 5 min per le celle a pellet.</li>
	<li>Aspirare il mezzo utilizzando un pipetto Pasteur sterile attaccato a un vuoto per rimuovere l'agente congelante. Resuspend cell pellet in 5 mL di mezzo fresco.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in un pallone o piatto trattato con coltura tissutale. Aggiungere abbastanza mezzo per coprire completamente il fondo del pallone e ruotare per distribuire uniformemente le cellule. Indicare il numero di passaggio a partire da "1".</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C in presenza del 5% di CO2 e dell'umidità fino a raggiungere la confluenza dal 95% al 100%. Controllare le cellule ogni giorno al microscopio a partire dal secondo giorno di incubazione. Non permettere alle celle di raggiungere la confluenza >100% in quanto ciò causerà il decollo e la morte delle cellule. NOTA: Il tempo necessario per raggiungere la confluenza dipende dal numero di cellule vive placcate e dall'area di crescita del pallone. Pertanto, è prudente controllare le cellule ogni giorno.</li>
	<li>Cellule di sottocoltura raschiando e diluendo il patrimonio cellulare in mezzo fresco consentendo almeno due giorni di crescita tra i raschiamenti. Aumentare il numero di passaggio di 1 con ogni sottocultura. NOTA: Il passaggio e la raschiatura immediata il giorno successivo si tradurranno in una perdita più rapida dell'aderenza generale delle cellule nel tempo. Raw 264.7 cellule devono essere utilizzate solo fino a circa il passaggio 15.</li>
	<li>Per placcare RAW 264.7 celle per il saggio OAA, sostituire con mezzo fresco e utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule dal pallone. Pipetta su e giù per rompere i grumi cellulari per un più facile conteggio delle celle. NOTA: Il metodo tradizionale per la subcultura di RAW 264.7 è la raschiatura. Nella nostra esperienza, l'uso della tripside fa sì che le cellule RAW 264.7 perdano aderenza nel tempo più velocemente rispetto alla raschiatura.</li>
	<li>Per contare le celle, diluire volumi uguali di celle e cercare una soluzione blu. Caricare 10 μL su un emocitometro. Osservare e contare il numero di cellule vive che escludono il colorante utilizzando un microscopio composto invertito con una lente obiettivo 10x.</li>
	<li>Piastra 1,4 x 104 celle vitali per pozzo in una piastra inferiore piatta di vetro spessa 96 ben 0,15 μm (piastra #1). Consentire alle cellule di crescere per 3 giorni. Sostituire il mezzo trascorso un giorno prima di eseguire OAA. NOTA: Dopo 3 giorni di incubazione, il numero di cellule dovrebbe essere di circa 5 x 104/ bene.</li>
</ol>2. Coltura e preparati batterici
NOTA: La specie batterica utilizzata in questo protocollo è un ceppo virulento incapsulato, B. anthracis Ames. Tutte le manipolazioni con questa specie richiedono adeguate autorizzazioni di biosicurezza e sicurezza e devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II o classe III situato in un laboratorio BSL-3. Seguire le procedure operative istituzionali per il lavoro BSL-3 e per l'uso di dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dei batteri.
<ol><li>Preparare il brodo di infusione di cuore cerebrale (BHI) sciogliendo 37 g di polvere BHI in acqua da 1 L e autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il brodo a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di bicarbonato di sodio all'8% in acqua e sterilizzare utilizzando una siringa filtrante da 0,20 μm. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 giorno.</li>
	<li>Mescolare 8 g di brodo nutriente, 3 g di estratto di lievito e 15 g di agar in 1 L di acqua per preparare piatti di agar NBY. Autoclave a 121 °C per 15 min. Versare nelle piastre di Petri e lasciare solidificare. Conservare le lastre a 4 °C. NOTA: Le piastre di agar NBY possono essere fatte con o senza bicarbonato di sodio. L'aggiunta di bicarbonato di sodio alle placche di brodo e agar induce la crescita di colonie di mucoidi costituite da bacilli incapsulati. La concentrazione finale di bicarbonato di sodio sia in mezzi liquidi che solidi è dello 0,8%.</li>
	<li>Preparare il brodo di coltura per B. anthracis mescolando il 50% di brodo BHI autoclavato, il 40% di FBS e la soluzione di bicarbonato di sodio al 10% (v/v). NOTA: Questo brodo è formulato per produrre brevi catene di bacilli incapsulati.</li>
	<li>Preparare un piatto principale di B. anthracis strizzandolo per l'isolamento su una piastra di agar NBY da uno stock di spore un giorno prima di coltivare in brodo. Incubare a 37 °C.</li>
	<li>Inoculare 30 ml di brodo di coltura in un pallone ventilato da 250 ml con diverse colonie di B. anthracis. NOTA: È necessario uno specifico rapporto volume/superficie del brodo, come specificato qui, per produrre bacilli incapsulati al massimo.</li>
	<li>Agitare la coltura del brodo a 125 giri/min, 37 °C con 20% di CO2 e umidità per 18-24 ore. NOTA: La coltivazione di B. anthracis a temperature superiori a 37 °C può inibire la produzione di capsule.</li>
	<li>Utilizzare la colorazione negativa con inchiostro indiano per garantire un incapsulamento sufficiente e che i bacilli siano in catene corte (1-5 bacilli/catena) prima della fissazione (vedere la sezione 3).</li>
	<li>Per determinare le unità di formazione delle colonie (CFU), diluire serialmente 100 μL di coltura 1:10 nella soluzione di soluzione di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e diluizioni di coltura delle placche sulle piastre di agar del sangue di pecora. Incubare per 12-18 h a 37 °C. Contare i CFC e determinare il numero di batteri per mL di coltura. NOTA: Il conteggio può anche essere eseguito utilizzando un emocitometro al microscopio una volta che i batteri sono stati riparato. Tuttavia, questo non è raccomandato perché i bacilli sono difficili da vedere sotto basso ingrandimento.</li>
	<li>Aggiungere il 16% di paraformaldeide (PF) all'intero volume della coltura batterica ad una concentrazione finale del 4% di PF per fissare i bacilli. Agitare lentamente su uno shaker a temperatura ambiente per 7 giorni. NOTA: Sette giorni di incubazione nel 4% di PF si basano sulla procedura operativa standard istituzionale USAMRIID per la fissazione dei bacilli vegetativi.</li>
	<li>Per rimuovere il fissativo e testare la sterilità, lavare tre volte 4 ml (10% di volume) di sospensione batterica fissa in un tubo conico da 50 ml per centrifugazione a ≥3000 x g per 45 min e utilizzando un 30 mL/lavaggio con PBS. Conservare il campione rimanente in PF al 4% a 4 °C. NOTA: Dopo la pellettizzazione, il pellet batterico è soffice a causa della presenza di capsula. Fare attenzione a non disturbare il pellet durante il lavaggio. È necessario rimuovere tutto il fissatore in modo che non interferisca con il test di fattibilità. Se necessario, aumentare il numero di lavaggi.</li>
	<li>Per le prove di vitalità, inoculare 40 mL di un mezzo di crescita batterico (ad esempio brodo BHI) con 4 mL di sospensione lavata (≤ 10% del volume di brodo) e incubare a 37 °C per 7 giorni. Controllare la densità ottica a 600 nm prima e dopo 7 giorni per misurare la torbidità.</li>
	<li>Dopo 7 giorni di incubazione nella coltura del brodo, ≥100 μL di brodo su una piastra di agar e incubare per altri 7 giorni. Se non si vede alcun aumento della torbidità e nessuna crescita sulle piastre, la coltura originale è considerata sterile e può essere trasferita in un laboratorio BSL-2. NOTA: Il Federal Select Agent Program22 impone che l'inattivazione di B. anthracis possa essere trasferita solo dai laboratori BSL-3 dopo aver dimostrato la completa sterilità del campione. Il test di vitalità per l'inattivazione B. anthracis consiste nel coltivare il 10% del campione in brodo per 7 giorni seguito da una coltura su terreno solido per altri 7giorni 22,23. Segui le linee guida istituzionali per ricevere l'approvazione del trasferimento una volta stabilita la sterilità.</li>
</ol>3. Colorazione negativa e microscopia leggera per osservare catene di incapsulamento e bacilli
<ol><li>Mescolare sospensioni batteriche da 5 μL con 2 μL di inchiostro indiano su uno scivolo al microscopio. Posizionare un vetro di copertura spesso 1 o 1,5 μm sopra la sospensione senza creare bolle. NOTA: Lo smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare il vetro di copertura sullo scivolo.</li>
	<li>Osservare le sospensioni batteriche utilizzando una lente obiettivo olio da 40x a 100x su un microscopio leggero. Assicurarsi che i bacilli siano incapsulati osservando una zona di gioco (la capsula esclude l'inchiostro indiano) che circonda ogni batterio e che le catene di bacilli siano corte.</li>
</ol>4. Etichettatura FITC dei batteri
<ol><li>Sciogliere l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) nel solfossido di dimetile ad una concentrazione di 2 mg/mL.</li>
	<li>Misurare il volume di stock batterico inattivato.</li>
	<li>Lavare il materiale 3 volte in PBS per rimuovere il fissatore.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione FITC ad una concentrazione finale di 75 μg/mL. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a 4 °C.</li>
	<li>Lavare tre volte i batteri pellettizzazione a ≥3000 x g, 45 min e utilizzando 30 mL PBS/lavaggio per rimuovere il FITC in eccesso. Assicurarsi che il pellet soffice non sia disturbato durante il lavaggio. Riutilizza i bacilli in PBS nello stesso volume iniziale.</li>
	<li>Aliquota e conservare i bacilli in microtubi a -20 °C fino all'uso. Non congelare/scongelare i bacilli più volte in quanto i bacilli potrebbero perdere capsula.</li>
</ol>5. Opsonizzazione batterica
<ol><li>Il calore inattiva un piccolo volume di sieri di prova (da SMP) a 56 °C per 30 minuti in un blocco termico.</li>
	<li>Scongelare e lavare i batteri marcati FITC con PBS 2x mediante pellettizzazione a 15000 x g per 3-5 minuti. Resuspend in PBS nello stesso volume iniziale.</li>
	<li>In una piastra inferiore ben rotonda 96 (piastra #2), diluire serialmente i sieri di prova in mezzo cellulare. In un'altra piastra inferiore ben rotonda (piastra #3), aggiungere 10 μL di sieri di prova diluiti in ogni pozzo. NOTA: In ogni piatto, PBS e normali sieri di scimmie sono stati inclusi al posto dei sieri di prova diluiti come controlli negativi. Abbiamo anche scelto un siero di prova come controllo positivo per generare una curva standard per normalizzare tutti i test eseguiti in giorni diversi. Il siero del test di controllo positivo è stato scelto arbitrariamente perché abbondante.</li>
	<li>Per placcare #3, aggiungere 10 μL di complemento di coniglio appena ricostituito. NOTA: Una volta ricostituito, scartare il complemento di coniglio rimanente; non ricongelare e scongelare.</li>
	<li>Per placcare #3, aggiungere il volume appropriato di bacilli etichettati FITC per una molteplicità di infezione di 1:20. Ad esempio, aggiungere il volume che contiene 5 x 104 x 20 bacilli per 5 x 104 celle. Completa ogni pozzo in lamiera #3 con il volume appropriato di cellulare medio-totale 105 μL. NOTA: La #1, che contiene cellule, riceve 100 μL di batteri opsonizzati con i restanti 5 μL come volume vuoto. Abbiamo testato ogni diluizione dei sieri di prova in duplice copia.</li>
	<li>Incubare la #3 a 37 °C per 30 min in presenza del 5% di CO2 con umidità per opsonizzare i bacilli.</li>
</ol>6. Saggio di aderenza ed etichettatura fluorescente delle cellule di mammifero
<ol><li>Mantenere tutti i reagenti a 37 °C prima dell'uso.</li>
	<li>Posizionare la #1, che contiene cellule aderenti, su un blocco termico a 37 °C.</li>
	<li>Utilizzare un pipettor multicanale per rimuovere il mezzo trascorso dai pozzi e sostituire rapidamente con 100 μL di batteri opsonizzati dalla piastra #3. Assicurarsi che non siano state generate bolle nei pozzi durante la pipettazione. Incubare la piastra #1 a 37 °C con 5% di CO2 e umidità per 30 minuti per aderenza.</li>
	<li>Lavare ogni pozzo 5x con PBS da 150 μL sopra un blocco termico a 37 °C per rimuovere i bacilli non attaccati. NOTA: Fare attenzione a garantire che le cellule non vengano disperse accidentalmente durante il lavaggio.</li>
	<li>Diluire il 16% di PF con PBS 1:4 per fare il 4% di PF. Fissare le celle con 4% di PF per 1 h aggiungendo 150 μL ad ogni pozzo. Lavare le celle 2 volte con PBS.</li>
	<li>Mescolare 2 μL HCS (screening ad alto contenuto) Orange Cell Stain in 10 mL PBS. Aggiungere 150 μL di questa soluzione di colorazione a cellule fisse e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i pozzi 2 volte con PBS.</li>
	<li>Conservare a 4 °C fino alla microscopia.</li>
</ol>7. Microscopia
NOTA: In generale, un microscopio a fluorescenza automatizzata ad alta produttività faciliterà l'imaging per l'OAA. Se non è disponibile un sistema automatizzato, le immagini fluorescenti dei bacilli aderenti possono essere prese manualmente21. In questo studio20,bacilli aderenti e monostrati cellulari sono stati coniati utilizzando il sistema di microscopia a scansione laser Zeiss 700 con apparecchiature specializzate; il nostro sistema era composto dal microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1 dotato di uno stadio automatizzato, dal modulo Definite Focus, dall'obiettivo 40 x NA 0.6, dalla telecamera Axio Cam HRc e dal software Zen 2012 (Blue Edition). Le immagini acquisite sono immagini widefield, non immagini confocali. Il seguente protocollo è inteso come una configurazione al microscopio di base applicabile a una varietà di sistemi di microscopia automatizzati.
<ol><li>Incubare la #1 a temperatura ambiente per 30 minuti. Accendere il microscopio e le relative apparecchiature. NOTA: L'acclimatazione a temperatura ambiente impedisce la formazione di condensa sulla piastra di vetro durante l'imaging. Inoltre, impedisce la sfocatizzazione a causa dello spostamento della temperatura.</li>
	<li>Posizionare la piastra sul palco e concentrarsi sulle celle utilizzando il campo luminoso o il contrasto di fase.</li>
	<li>Selezionare il formato 96 e l'impostazione della piastra. Selezionare le impostazioni del canale. NOTA: L'eccitazione di picco e la lunghezza d'onda di emissione di FITC sono di 495/519 nm; la macchia di cellule arancioni HCS è di 556 e 572 nm. Altri fluorofori possono essere utilizzati a seconda dei filtri disponibili al microscopio.</li>
	<li>Selezionare l'impostazione per la modalità riquadro. Indicare il numero di immagini da acquisire. NOTA: la funzione di piastrellatura consente l'acquisizione di più posizioni in un pozzo campione e può essere impostata per acquisire immagini in un accodamento o in un formato casuale. Abbiamo immaginato 10 aree casuali per pozzo.</li>
	<li>Cambia la modalità di acquisizione in "bianco e nero" o "monocromatico" e binning ≥ 2x2. NOTA: L'impostazione del binning da 1x1 a 2x2 o 4x4 aumenterebbe la velocità della microscopia, ma comporterebbe anche una risoluzione inferiore dell'immagine. Per l'OAA, è sufficiente utilizzare queste impostazioni poiché il saggio enumera sia i macrofagi che i batteri aderenti.</li>
	<li>Attivare il modulo di messa a fuoco automatica o di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica. Attivare la funzione Z stack, se disponibile. Indicare il numero di pile Z che cattureranno lo spessore del monostrato di cellule e dei bacilli aderenti. NOTA: il numero di pile Z scelte aumenterà il tempo di microscopia, ma assicurerà che un'immagine con lo stato attivo corretto sia scattata in ogni pila Z.</li>
	<li>Designare una cartella di file in cui salvare le immagini. Eseguire il programma di imaging automatizzato.</li>
</ol>8. Raccolta e analisi dei dati
<ol><li>Contare il numero di bacilli aderenti e cellule di mammiferi per immagine. Contare ogni catena di bacilli come un batterio.</li>
	<li>Tracciare i bacilli/cellule del siero e del titolo del test di controllo positivo (ad esempio, la diluizione 1:10 è di 10 unità di titolo) per generare una curva standard in un programma statistico appropriato.</li>
	<li>Analizzare il siero di prova del controllo positivo utilizzando il raccordo della curva di regressione non lineare. Quindi analizzare i campioni rimanenti utilizzando la curva standard del siero di prova di controllo positivo per determinare i titer corrispondenti. NOTA: Di solito è più accurato scegliere le diluizioni del campione vicino al centro della curva standard quando si determinano i titolori.</li>
	<li>Calcola la media geometrica dei campioni di ogni gruppo di vaccini. Calcolare i valori P- dei formicolii trasformati di log in base all'analisi ANOVA della differenza meno significativa.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno un'associazione commerciale o di altro tipo che potrebbe rappresentare un conflitto di interessi.

I vaccini a base di capsule hanno dimostrato di essere efficaci contro numerosi agenti patogeni batterici e molti sono autorizzati perl'uso nell'uomo 25,26,27. Questi vaccini funzionano generando anticorpi mirati alla capsula e molti di questi studi utilizzano l'OPKA per mostrare le funzioni opsono-fagocitichedegli anticorpi 13,14,16,<s...

Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi1, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell'ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 18832,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra "non-sé infettivo" e "sé non infettivo" attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)4,5. Il riconoscimento dell'ospite di un agente patogeno può verificarsi anche con il legame delle opsonine ospiti, come complemento eanticorpi 6. Questo processo, chiamato opsonizzazione, ricopri l'agente patogeno con queste molecole, migliorando l'internalizzazione al legame con i recettori opsonici (ad esempio, complemento e recettori Fc) sulle cellule fagocitiche6. Affinché un agente patogeno aderisca a un fagocita, è necessario il legame collettivo di più recettori con i loro ligandi affini. Solo allora l'aderenza può attivare e sostenere le cascate di segnalazione all'interno della cella host per avviare l'internalizzazione6.
A causa dell'importanza della fagocitosi nella clearance degli agenti patogeni e nella prevenzione delle infezioni, gli agenti patogeni extracellulari hanno sviluppato numerosi modi per sovvertire questo processo per prolungarne la sopravvivenza. Una strategia importante è la produzione di una capsula polimerica anionica (ad esempio polisaccaride o poliaminoacido) che è anti-fagocitica in virtù della sua carica, è scarsamente immunogenica e protegge le molecole sull'involucro batterico dai PRR6,7. Agenti patogeni come Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae hanno capsule composte da polimeri saccharide, mentre Staphylococcus epidermidis e alcune specie di Bacillus producono acido poli-ɣ-glutammico (PGGA)7,8. Tuttavia, altri agenti patogeni producono capsule che assomigliano all'io non infettivo. Ad esempio, lo Streptococcus pyogenes e un ceppo patogeno di B. cereus hanno una capsula di acido ialuronico che non è solo anti-fagocitico ma che potrebbe anche non essere riconosciuta come estranea dal sistema immunitario9,10.
La coniugazione della capsula in proteine portanti li converte da antigeni poveri e indipendenti dalla T in antigeni altamente immunogenici dipendenti da T che possono indurre alti tigatori di anticorpi anti-capsula sierati11,12. Questa strategia viene utilizzata per i vaccini autorizzati contro S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee Neisseria meningitides11. Le attività opsoniche degli anticorpi anti-capsula sono state comunemente valutate da test di uccisione opsono-fagocitica (OPKA)13,14,15,16. Questi test testano se gli anticorpi funzionali possono innescare la fagocitosi e uccidere14. Tuttavia, l'uso di OPKA con agenti patogeni infettivi, come agenti e tossine di selezione biologica di livello 1 (BSAT), tra cui B. anthracis17, è pericoloso e presenta rischi per la sicurezza; questi saggi richiedono un'ampia gestione di un agente selezionato. La manipolazione di agenti selezionati può essere effettuata solo in laboratori di livello di biosicurezza limitato 3 (BSL-3); il lavoro in questi settori richiede procedure operative prolungate a causa delle numerose precauzioni di sicurezza che devono essere seguite. Anche i laboratori BSL-3 in genere non sono dotati delle attrezzature specializzate utilizzate per il lavoro OPKA, come microscopi e citometri. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio alternativo basato sull'uso di batteri inattivati18,19. Ci riferiamo a questo come un saggio opsono-aderenza (OAA) che non dipende dall'internalizzazione e dall'uccisione delle uscite di saggio; invece, l'aderenza di agenti patogeni inattivati opsonizzati è usata come indice di fagocitosi. Meccanicamente, L'OAA è un sostituto adatto perché l'aderenza avviene a priori ed è intimamente intrecciata con l'internalizzazione e l'uccisione intracellulare. Dal punto di vista della biosicurezza, l'OAA è preferito perché richiede una manipolazione minima di un agente infettivo, è sperimentalmente di durata inferiore rispetto all'OPKA e può essere eseguito nei laboratori BSL-2 dopo che uno stock di agente patogeno inattivato è stato prodotto e trasferito.
Dimostriamo l'utilizzo dell'OAA per esaminare la funzione opsonica degli anticorpi anti-capsule trovati nei sieri di primati non umani (NMP) vaccinati con un coniugato a capsula [cioè PGGA da B. anthracis coniugato al complesso proteico della membrana esterna (OMPC) di Neisseria meningitides]20. I bacilli opsonizzati al siero sono stati incubati con una linea cellulare di macrofagi di topo aderente, RAW 264.7. Dopo la fissazione, il monostrato cellulare e i bacilli aderenti sono stati immaginiti dalla microscopia a fluorescenza. L'aderenza batterica è aumentata quando i bacilli sono stati incubati con siero da NSP vaccinati con il coniugato della capsula rispetto al siero di controllo20. Aderenza correlata alla sopravvivenza della sfida dell'antrace20,21. Pertanto, l'uso di OAA ha caratterizzato la funzione degli anticorpi anti-capsula e ha notevolmente facilitato il test del nostro candidato vaccino.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.20 &#181;m syringe filter (25mm, regenerated cellulose)</td>
			<td style="width:483px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:267px;">431222</td>
			<td style="width:391px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mL syringe (Luer-Lok tip)</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15&#181; 96 well black plates (plate #1 for imaging)</td>
			<td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td>
			<td>P96-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">75 cm sq. tissue culture treated flask</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Baby Rabbit Complement</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td>
			<td>CL3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates</td>
			<td>Remel, Lenexa, KS</td>
			<td>R01198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt, Newton, NC</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Costar 96 well cell culture plates (plates #2 &#38; 3 for dilutions)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>72200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Difco Nutrient Broth</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>234000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope)</td>
			<td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>not gamma irradiated, not heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>F143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>H32713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hemocytometer (Improved Neubauer)</td>
			<td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td>
			<td>3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">India Ink solution</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>261194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L- glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td>
			<td>25030081</td>
			<td>supplement medium with additional 2mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope)</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS without Calcium or Magnesium</td>
			<td>Lonza, Walkersville, MD</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petri dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon, Corning, Durham, NC</td>
			<td>351029</td>
			<td>for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td>
			<td>4109001865956000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsono-adherence assay to evaluate functional antibodies in vaccine development against bacillus anthracis and other encapsulated pathogens

Il saggio opsono-aderenza è un saggio funzionale che enumera l'attaccamento di agenti patogeni batterici ai fagociti professionisti. Poiché l'aderenza è necessaria per la fagocitosi e l'uccisione, il saggio è un metodo alternativo ai test di uccisione opsono-fagocitica. Un vantaggio del saggio opsono-aderenza è la possibilità di utilizzare agenti patogeni inattivati e linee cellulari di mammiferi, che consente la standardizzazione in più esperimenti. L'uso di un agente patogeno inattivato nel saggio facilita anche il lavoro con agenti infettivi di livello di biosicurezza 3 e altri agenti patogeni virulenti. Nel nostro lavoro, il saggio opsono-aderenza è stato utilizzato per valutare la capacità funzionale degli anticorpi, dai sieri di animali immunizzati con un vaccino a base di capsula di antrace, per indurre l'aderenza del Bacillus anthracis fisso a una linea cellulare di macrofagi del topo, RAW 264.7. La microscopia a fluorescenza automatizzata è stata utilizzata per catturare immagini di bacilli che aderiscono ai macrofagi. L'aumento dell'aderenza è stato correlato con la presenza di anticorpi anti-capsula nel siero. I primati non umani che mostravano alte concentrazioni di anticorpi anti-capsula sierati erano protetti dalla sfida dell'antrace. Pertanto, il saggio opsono-aderenza può essere usato per chiarire le funzioni biologiche degli anticorpi specifici dell'antigene nei sieri, per valutare l'efficacia dei candidati al vaccino e di altre terapie e per servire come possibile correlato dell'immunità.

Questa sezione mostra le micrografie rappresentative raccolte durante un esperimento OAA insieme ai risultati che mostrano che l'OAA può essere utilizzato per esaminare la funzione biologica degli anticorpi. Qui, il test è stato utilizzato con successo per valutare l'efficacia di un candidato al vaccino contro l'antrace. È fondamentale verificare lo stato di incapsulamento sui bacilli poiché il poco o nessun incapsulamento li fa aderire alle cellule ospiti, producendo uno sfondo elevato. La figur...

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Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

opsono-adherence-assay-to-evaluate-functional-antibodies-vaccine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

3.3K Views.  United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Video: Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

Utilizzando organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo per studiare e modificare la protezione delle cellule epiteliali contro la Salmonella e altri patogeni

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

Determinazione dell'efficienza dell'inibitore chimico contro la crescita intracellulare del Toxoplasma Gondii utilizzando un saggio di crescita basato su Luciferase

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...