Name: image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
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The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue descritte in questo metodo sono state condotte in accordo con la Dichiarazione di Helsinki e approvati dal Comitato Etico UNT (IRB) per i soggetti umani. Tutti i soggetti hanno dato il consenso scritto per la raccolta del sangue, che è stato utilizzato nel metodo attuale per garantire che essi erano apparentemente sani, di peso corporeo normale, e libero da malattia. 1. reagente Fonte &amp; Preparazione <ol><li> Utilizzare CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) e CD45-APCeFluor780 (clone # 2D1; DF = 1: 50) per questo test. NOTA: Prima dello studio, gli anticorpi CD45 e CD66b sono stati titolati per determinare la diluizione ottimale che granulociti chiaramente risolti (CD45 + / 66b +) da altri leucociti (CD45 + / 66b-) 11. Dopo aggiunta dell&#39;anticorpo diluita per colorazione diluizione finale nel tubo era 875. </li><li> Acquisto e disgelo stock S. aureus bioparticelle etichettato con pHrodo colorante rosso. Sospensione ad una concentrazione di 1 mg di bioparticelle per ml in PBS sterile. Aliquota bioparticelle diluite e conservare congelati a -20 ° C fino al momento del test. </li><li> Sciogliere dihydroethidium (DHE), che viene convertito in etidio bromuro di fluorescenza in presenza di radicali liberi di ossigeno (cioè, burst ossidativo), in DMSO ad una concentrazione finale di 10 g / ml. </li><li> Mescolare N-etilmaleimmide (usato per prevenire fagocitosi supplementare dopo la durata dell&#39;incubazione dosaggio specificato) con PBS sterile in una diluizione 2 step di 200 mg / ml e 17,5 mg / ml. Nel saggio, utilizzare una concentrazione finale di 15 mM. Quando scongelamento N-etilmaleimmide, utilizzare un blocco di calore a 37 ° C, come N-etilmaleimmide non rimane in soluzione. </li><li> Dopo la fase di fissazione finale, utilizzare 7AAD a macchiare DNA nucleare. Prima Inoltre, diluire magazzino 7AAD 1:10 con PBS sterile. </li></ol> 2. Campione di sangue Collection <ol><li> Fare soggetti ad arrivare al laboratorio a seguito di un O / N veloce (&gt; 8 ore) e abstentisu dall&#39;attività fisica (&gt; 12 ore). </li><li> Dopo aver pulito la pelle con un panno imbevuto di alcol preparazione, inserire una sterile raccolta del sangue ago in un braccio vena periferica. </li><li> Prelevare il sangue in tubi sottovuoto che sono in commercio pieni di eparina sodica. </li><li> Dopo la raccolta, applicare un bendaggio adesivo al braccio del soggetto. </li><li> Capovolgere i tubi del sangue di mescolare per 10 volte e poi posto su una sedia a dondolo fino al momento dell&#39;analisi. </li></ol> Tecnica 3. Fagocitosi Assay <ol><li> Bioparticelle Thaw S. aureus (RT), DHE (RT), e N-etilmaleimmide (37 ° C). </li><li> Aggiungere 20 L di bioparticelle S. aureus a 4 singoli 1,2 ml provette durante il lavoro nella cappa sterile. </li><li> Aggiungere 40 L di DHE ad ogni provetta contenente le bioparticelle. </li><li> Battere delicatamente i tubi sul banco di lavoro per raccogliere i reagenti nel fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 100 L di sangue intero misto di ogni tubo che è stato riempito con bioparticelle e DHE. </li><li>Pulire il bordo interno dei tubi con un applicatore con punta di cotone per rimuovere il sangue contaminante. </li><li> Mescolare il sangue e reagenti con una pipetta elettronico impostato mescolare il sangue e reagenti per tre cicli dopo aggiunta di sangue. </li><li> Mettere le provette in un secchio di ghiaccio e coprire al riparo dalla luce. </li><li> Incubare le provette per 10, 20, e 40 min. Iniziare con il tubo 40 min a garantire tutte le provette terminano contemporaneamente. </li><li> Scongelare N-etilmaleimmide in 37 ° C bagno tallone. </li><li> Pipettare 15 L di N-etilmaleimmide (descritto in 1.4) in ogni provetta, incubare per 30 minuti. </li><li> Dispensare 10 L di CD66b-APC e 10 L di CD45-APCeFluor780 anticorpi diluiti (sopra descritti in 1.1), incubare per 60 min. </li><li> Dispensare 750 L di fix soluzione Lyse / RBC WBC in ciascuna provetta, incubare per 60 min. </li><li> Centrifuga (10 min a 400 xg) provette per raccogliere il pellet. </li><li> Vacuum aspirare la soluzione lyse WBC / RBC fix, lasciando un residuo flVolume UID (100 L) sopra il pellet di cellule. </li><li> Dispensare 10 L di soluzione diluita 7AAD (descritto in 1.5) e 50 L di PBS in ogni provetta test. </li><li> Aggiungere una goccia di perline di taratura (~ 25 L) a ciascuna provetta, luogo tappi sulle provette, tubi avvolgere in un foglio, e posto in frigorifero. </li><li> Caricare la provetta nel flusso basato su immagini citometro e raccogliere un minimo di 3.000 eventi granulociti utilizzando parametri predefiniti: Autocampionatore, blu (488 nm; 60 mW), rosso (640 nm, 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW) laser (Figura 1). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Figura 1. Metodo &amp; Template Acquisition. I campioni sono stati acquisiti su un flusso basato su immagini citofluorimetro (A). Durante l&#39;acquisizione, dot plots di brillante campo Proporzioni vs. CD66b-APC sono stati generati per granulociti separati dal spillo perline calibrazione usinsoftware g INSPIRE v. 100.2.292.0 (B). Un minimo di 5.000 granulociti sono stati acquisiti per ogni campione utilizzando un campionatore automatico, blu (488 nm; 60 mW), rosso (640 nm, 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW) laser. Si prega di notare che un certo numero di istogrammi sono presenti durante l&#39;acquisizione di controllare le impostazioni di laser e altri aspetti dei dati raccogliere. Tutti questi istogrammi sono opzionali e necessaria solo se le procedure operative standard di laboratorio li richiede il controllo della qualità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. Acquisizione e Sample Analysis <ol><li> Utilizzare la procedura guidata automatica compensazione software del software IDEAS di applicare una matrice di compensazione per i file di immagine grezzi (RIF) e creare compensare i file immagine (CIF). </li><li> Caricare singoli file CIF in software IDEAS e generare i seguenti complotti per identificare i sottoinsiemi granulociti: </li&gt; <li> Stabilire porte iniziali per identificare le cellule che sono state considerate a fuoco utilizzando un istogramma per RMS di gradiente di campo luminosi (Figura 2a). Rendere questa determinazione per ciascun campione usando il controllo non stimolato come standard di riferimento. </li><li> Utilizzare trame secondarie alle cellule singoletto separati da detriti e doppiette utilizzando un diagramma a punti di brillanti proporzioni settore (rapporto tra altezza della cella vs larghezza) vs. zona di campo luminoso (Figura 2B). Rendere questa determinazione per ciascun campione usando il controllo non stimolato come standard di riferimento. </li><li> Una volta che una popolazione di cellule pulita era stato identificato, creare un diagramma a punti di CD45 vs. CD66b (Figura 2C) per identificare positivamente granulociti (CD45 + / 66b +). Creare una trama figlia (Figura 3) della brillante intensità dettaglio per S. aureus (asse x) vs. brillante intensità dettaglio per burst ossidativo (DHE, asse y) per identificare sottogruppi di granulociti attivati. Raccogliere brimmagini campo ight del Canale 1 e 9, bioparticelle a Channel 2, DHE a Channel 4, 7AAD in Canale 5, CD66b in Channel 11, e CD45 in Channel 12. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Figura 2. Analisi del modello. Questa figura la serie di trame che sono stati generati per identificare le cellule che erano a fuoco (A), celle singole (B), granulociti (C). Trame supplementari sono stati usati per identificare i tre sottoinsiemi di granulociti attivati ​​contro granulociti inattive. Tutte le analisi di file di immagini acquisite è stato completato utilizzando il software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. 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C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. 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The authors have nothing to disclose.

L&#39;attuale metodo rappresenta un perfezionamento dei metodi esistenti per la valutazione della funzione dei granulociti citometria a flusso 1,3,4,12-14. I passaggi critici di questo test tendono ad essere correlato alla corretta miscelazione del campione di sangue con i bioparticelle e DHE. Miscelazione incompleta si tradurrà in risultati imprecisi. Mentre la completa miscelazione è critica, il metodo di miscelazione deve essere dolce in natura. Si suggerisce che la miscelazione essere realizzato utilizzando una pipetta elettronico con una funzione di miscelazione piuttosto che un vortex. Un altro punto critico nel saggio è garantire sempre non c&#39;è sangue contaminare la metà superiore della provetta. Questo sangue residuo può essere rimosso con un cotton fioc sterili. La rimozione completa è importante perché in caso contrario si potrebbe contaminare la preparazione finale del test con i globuli rossi non-lisato. Prima di utilizzare questo metodo di adeguati controlli di compensazione dovrebbe essere aggiunto al controllo per spectral sovrapposizione tra i reagenti utilizzati per identificare i diversi aspetti della funzione di granulociti. Per questo metodo, controlli di compensazione comportano raccogliere campioni di sangue che sono stati suggeriti 40 min di incubazione dosaggio e poi etichettatura con un singolo marcatore (cioè, E. coli, DHE, ecc). Dopo l&#39;etichettatura, i singoli eventi positivi vengono raccolti e una matrice di compensazione viene generato tramite un wizard automatico nel software di analisi IDEE. E &#39;fondamentale che se si utilizza questo test, adeguati controlli di compensazione sono stati completati per garantire prestazioni adeguate del dosaggio. L&#39;analisi viene eseguita mediante la funzione Finder e co-localizzazione procedure guidate per identificare che brillante intensità dettaglio è il miglior variabile per separare le popolazioni ed anche identificare come esiste molta sovrapposizione tra burst ossidativo e segnali fagocitosi. In particolare, l&#39;uso di immagini basato citometria disponibile la capacità di separare granulociti attivati ​​in tre sottoinsiemi. Tla sua ripartizione sottoinsieme è stato determinato utilizzando luminosa intensità dettaglio di fagocitosi vs. burst ossidativo. Oltre a esaminare queste funzioni cellulari singolari, cellule che mostravano entrambi gli eventi contemporaneamente nella stessa posizione anatomica (co-localizzazione) sono stati identificati. Granulociti che cadde nel sottoinsieme &quot;high-attiva&quot; erano l&#39;unico che ha dimostrato fenotipo coerente co-localizzazione tra fagocitosi e burst ossidativo. Questa identificazione di sottoinsiemi granulociti attivati ​​è la più grande area in cui è necessaria la risoluzione dei problemi. E &#39;molto importante per un nuovo utente di prendere tempo per capire il workflow di processo del campione in idee e per capire i meccanismi di gating le popolazioni cellulari utilizzando il componente di imaging. Altre modifiche che un utente può cercare di rendere comprendono la selezione dei tempi alterni o ulteriori test di incubazione. Il metodo attuale suggerisce l&#39;uso di una durata di 10-40 min; Tuttavia, a seconda del modello sperimentale in cui questo metodo èda utilizzare, può essere necessario selezionare durate dosaggio più. Tale modifica dovrebbe essere valutato su base individuale. Inoltre è stato stabilito che la durata dell&#39;incubazione dosaggio ha un effetto significativo sulla comparsa delle tre sottoinsiemi attivati. L&#39;approccio descritto in questo rapporto rappresenta un ampliamento di quali informazioni possono essere ottenute in precedenza per quanto riguarda la funzione di granulociti 3,4,13,15. Altri laboratori hanno dimostrato l&#39;importanza di valutare i cambiamenti nella funzione dei granulociti nel quadro di una valutazione globale di immunità e malattia 15-17. Nonostante il potenziale di questo test non è senza limitazioni. Una delle maggiori limitazioni è domanda Costi e tempi associati con elevata campione trasformazione produttività. Quando un disegno studio richiede un gran numero di campioni in un dato giorno, questi possono essere difficili da trattare. Il trattamento è semplificato dall&#39;uso di pipette elettroniche e dispenser,ma queste tendono ad essere costosi e non sono necessariamente disponibili in ogni laboratorio. La nostra area di ricerca si concentra su uno studio di come l&#39;esercizio fisico e le abitudini alimentari influenzano la salute del sistema immunitario e la funzione 6,8-10,18-20. Tali obiettivi hanno importanti implicazioni pratiche per una varietà di aree della salute umana. Oltre lo studio di esercizio e nutrizionali effetti il ​​metodo fagocitosi dimostrato in questo manoscritto potrebbe essere utile in altre zone del immunologia clinica dove il monitoraggio delle funzioni fagocitosi è fondamentale per i risultati del trattamento. Il presente saggio è il primo di molti che saggi immunologici con la possibilità di essere reinventate prendendo i vantaggi delle informazioni di imaging unica che può essere in grado da un flusso basato su immagini citometro.

Granulociti costituiscono una componente di sistema immunitario innato del corpo, che fornisce la prima linea di difesa contro gli antigeni invasori. I metodi precedenti per valutare la funzione dei granulociti concentrati sulla capacità di fagocitosi o burst ossidativo con metodi diversi, il che rende difficile accertare collettivamente come granulociti sono cambiati 1-4. I progressi nel campo della citometria a flusso hanno portato alla produzione di strumenti da banco capaci di alta risoluzione, multicolore imaging cellule in maniera high throughput 5. La capacità di coniugare l&#39;imaging con il flusso tradizionale rappresenta citometria un avanzamento che fornisce la piattaforma tecnologica necessaria per innovare nel flusso esistenti citometria metodi ed estrarre nuove informazioni sul sistema immunitario. Negli ultimi dieci anni, il nostro laboratorio, tra gli altri, è stato acutamente focalizzata sull&#39;effetto di vari patte nutrizionale e trattamenti eserciziorns sulla funzione immunitaria innata 6-9. Il metodo illustrato in questo manoscritto ha implicazioni pratiche nel campo della immunologia clinica. Il presente metodo sfrutta la potenza di image-based citometria a flusso per misurare simultaneamente la fagocitosi di particelle batteriche e burst ossidativo. Usando questo approccio, si è in grado di separare granulociti attivati ​​utilizzando variabili forniti dalla parte dell&#39;immagine basata dell&#39;analisi. Questi sottoinsiemi erano identificabili solo dopo aver valutato le immagini cellulari sui singoli granulociti. Ulteriore tempo di incubazione test influenzato la transizione tra i tre sottoinsiemi di attivazione 10. Così, è plausibile che uso di più tempi di incubazione può autorizzare un metodo per testare l&#39;cambiamento nella funzione granulociti seguendo un trattamento sperimentale specifica. Lo scopo di questo manoscritto era di dimostrare un metodo di valutazione della funzione dei granulociti utilizzando un&#39;immagine basata citometria a flusso per misurare simultaneamente fagocitosi con oxidative scoppiare.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>used for blood collection</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC Lysis solution</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;S. aureus&lt;/i&gt; bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-channel pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Used for IDEAS analysis</td></tr></tbody></table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Utilizzando basato su immagini citometria a flusso ha permesso di separare una popolazione omogenea di granulociti attivati ​​in tre diversi sottoinsiemi di attivazione (Figura 3). In questo metodo, il modo più efficace per risolvere i tre sottoinsiemi di attivazione è tracciando luminoso intensità dettaglio per fagocitosi (S. aureus) vs. burst ossidativo (DHE) (Figura 3; la figura 4). Inoltre, l&#39;utilizzo della procedura guidata co-localizzazione in software IDEAS consentirà la quantificazione della presenza di fagocitosi simultanea e burst ossidativo, che è un segno distintivo di granulociti altamente attivati. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Figura 3. Identificazione attivati ​​granulociti sottoinsiemi. Dopo l&#39;identificazione di granulociti mediante marcatori della superficie cellulare (CD45 + / 66b +), un complotto figlia è stata generata con brillante dettaglio intensità di fagocitosi vs. brillante intensità dettaglio per burst ossidativo. Usando questo approccio, la percentuale di inattivi (viola), basso-attivo (rosso, A), moderata-attiva (blu, B), e (C, giallo) granulociti alto-attiva è stata determinata. Questa tecnica gating è stato anche utilizzato per valutare l&#39;effetto del tempo di incubazione del test sulla abbondanza relativa dei vari sottogruppi granulociti attivati. La più alta percentuale di granulociti &quot;alto-attiva&quot; è stata presente dopo l&#39;40 min di incubazione. Tutte le analisi di file di immagini acquisite è stato completato utilizzando il software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Oltre a dimostrare la presenza di tre sottoinsiemi distinti di granulociti attivati, è stato dimostrato che il tempo di incubazione del test influenzato l&#39;abbondanza relativa di ogni granulociti attivato sottoinsieme. In particolare, il 40 min incubation portato alla maggiore percentuale di granulociti &quot;alto-attiva&quot;. Includendo almeno tre durate incubazione dosaggio può essere possibile determinare come un dato trattamento clinico altera lo stato di attivazione temporale dei granulociti. Questo è il primo metodo pubblicato utilizzando un&#39;immagine basata citometria a flusso per identificare diversi sottoinsiemi granulociti attivati ​​in funzione di misurazione simultanea dello fagocitosi e burst ossidativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Figura 4. Immagini rappresentative della Cellular marcatori. Una galleria di immagini di cellule classificate come high-attiva (A), moderata-attiva (B), e basso-attivo (C) viene presentato in questa figura. Bioparticelle S. aureus sono in Ch03 , burst ossidativo è in Ch04, 7AAD per il nucleo è in CH05, scatter lato è in CH06, CD66b è inCH11, e CD45 è in CH12. Inoltre, viene visualizzata un&#39;immagine di unione co-localizzata di fagocitosi (Ch03) vs. burst ossidativo (Ch04). Aree di giallo l&#39;immagine di unione in denotano che la fagocitosi e burst ossidativo stanno verificando nello stesso spazio anatomica nello stesso momento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.5K Views.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Video: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Neuroscienze

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

Source: Do&#241;a, I. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62600">Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

Analisi dell'attivazione dei basofili in presenza di un allergene del test mediante citometria a flusso

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Sample preparation

	Collect ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Misurazione dell'assorbimento microgliale di particelle fluorescenti erogate per via intravitreale mediante citometria a flusso

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione

Riepilogo

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