Questo protocollo consente la purificazione delle cellule T INK, che sono molto rare, e consente un'espansione di 30 volte nel loro numero. La purificazione può essere eseguita in un giorno e produrre un gran numero di cellule T INK pronte all'uso per studi in vivo e in vitro in due settimane. A dimostrare la procedura sarà Gloria Delfanti, post-doc in laboratorio.
Dopo aver sezionato la milza di topo, romperla attraverso un filtro a celle da 70 nanometri per ottenere una sospensione a singola cellula in 10 millilitri di PBS con il 2% di FBS. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con un millilitro di tampone sterile di cloruro di ammonio potassio lisina.
Incubare le cellule per tre minuti a temperatura ambiente, quindi bloccare con cinque millilitri di PBS con il 2% di FBS. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospese il pellet cellulare in tre millilitri di PBS con 2% FBS e rimuovere i residui di grasso mediante pipettaggio.
Per le fasi di arricchimento, mantenere le celle fredde e utilizzare soluzioni pre-raffreddate a quattro gradi Celsius e quindi mantenute sul ghiaccio. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere tutte le cellule nella quantità appropriata di PBS con bloccante 2% FPS e Fc e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Lavare con uno o due millilitri di tampone di separazione MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, colorare le cellule con CD19-FITC e H2-IAb-FITC e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius. Lavare le celle aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti.
Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in 90 microlitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule. Aggiungere 10 microlitri di microsfere anti-FITC per 10 milioni di cellule. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius.
Lavare le cellule aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere fino a 125 milioni di cellule in 500 microlitri di buffer MACS. Posizionare una colonna LD nel campo magnetico del separatore MACS.
Per evitare intasamenti, applicare un filtro di pre-separazione sulla colonna LD e risciacquarla con due millilitri di buffer MACS. Applicare la sospensione cellulare sul filtro e raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso la colonna. Lavare il serbatoio della colonna vuoto tre volte con un millilitro di buffer MACS.
Raccogliere l'effluente arricchito con cellule T e contare le cellule, mantenendo 50 microlitri per l'analisi FACS. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, rimuovere il surnatante e macchiare le cellule con CD1d tetramer-PE. Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio sul ghiaccio.
Lavare le celle aggiungendo da uno a due millilitri di buffer MACS per 10 milioni di celle. Dopo la centrifugazione a 300 volte G per 10 minuti, rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in 80 microlitri di tampone MACS per 10 milioni di cellule. Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-PE per 10 milioni di cellule.
Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a quattro-otto gradi Celsius. Lavare le celle aggiungendo uno o due millilitri di tampone MACS per 10 milioni di celle e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere fino a 100 milioni di cellule in 500 microlitri di buffer MACS.
In base al conteggio delle celle, posizionare la colonna LS o MS nel campo magnetico del separatore MACS e risciacquare la colonna con il buffer MACS. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna, raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso e lavare la colonna tre volte come descritto in precedenza. Questa è la frazione negativa.
Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta. Pipettare il buffer MACS sulla colonna e spingere lo stantuffo fornito nella colonna per scovare la frazione positiva arricchita in celle T INK. Per aumentare ulteriormente il recupero delle cellule T INK, centrifugare la frazione negativa a 300 volte G per 10 minuti e ripetere i passaggi precedenti con una nuova colonna LS o MS.
Tirare le frazioni positive e determinare il conteggio delle cellule. Conservare 50 microlitri di frazioni sia positive che negative per l'analisi FACS per verificarne la purezza. Per attivare le cellule T INK con un rapporto uno-a-uno, trasferire il volume appropriato di perline magnetiche anti-CD3 e CD28 su un tubo e ad un volume uguale di PBS, quindi vortice per cinque secondi.
Posizionare il tubo su un magnete per un minuto ed eliminare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospescere le perle magnetiche lavate nel giusto volume di RPMI. Centrifugare le cellule T INK purificate a 300 volte G per cinque minuti e mescolarle con perline magnetiche anti-CD3 o CD28 dell'attivatore T del mouse.
Piastra un millilitro della sospensione cellulare, perline magnetiche anti-CD23 e CD28 in una piastra a 48 pozzetti con 20 unità per millilitro IL-2, quindi incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque giorni, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro IL-7. Dividere le cellule a metà quando raggiungono l'80-90% di confluenza, aggiungendo sempre 20 unità per millilitro IL-2 e 10 nanogrammi per millilitro IL-7.
In queste condizioni, le cellule T INK possono essere espanse fino a 15 giorni. Utilizzando questo protocollo, le cellule T INK sono arricchite dalla milza di topi transgenici attraverso un processo di separazione immunomagnetica. Dopo l'arricchimento, le cellule possono essere espanse con perline anti-CD3 e CD28, con conseguente espansione di 30 volte in media entro il giorno 14 della coltura.
La forte attivazione con perline anti-CD3 e anti-CD ha indotto la downregulation dell'espressione del TCR delle cellule T IMK sulla superficie cellulare ed è apparsa una doppia popolazione negativa. La maggior parte delle cellule T INK espanse sono CD4 negative. La caratterizzazione dei fattori di trascrizione specifici del lignaggio PLZF e ROR gamma T ha permesso di identificare i fenotipi NKT1, NKT2 e NKT17 su cellule T INK arricchite al giorno zero e 14.
Le cellule T INK arricchite mostrano un fenotipo effettore simile a T80, che viene conservato dopo 14 giorni di espansione come confermato dalla secrezione di interferone gamma e IL-4 dopo stimolazione di PMA e ionomicina. Durante le fasi di purificazione, ricordarsi di lavorare velocemente con soluzioni pre-raffreddate e di eliminare eventuali residui di grasso che possono essere visti durante il pipettaggio. Le cellule T INK espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e trasferimenti in vivo nei topi, anche dopo modifiche funzionali tramite trasferimento genico o modifica.
L'espansione in vitro delle cellule T INK supera il limite dato dalla scarsità, rendendole sfruttabili in studi preclinici nei campi della sorveglianza immunitaria tumorale, delle malattie infettive e dell'autoimmunità.
