Questo sistema di cocoltura ex vivo può essere utilizzato per identificare nuovi meccanismi cellulari e molecolari della migrazione cellulare del glioma umano e potrebbe potenzialmente essere utilizzato per test di efficacia dei farmaci in vitro. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di studiare le interazioni tra cellule di glioblastoma umano e assoni in tempo reale. A dimostrare la procedura sarà John Zepecki, uno studente laureato del mio laboratorio.
Per assemblare piatti di coltura compartimentati, diluire la soluzione di collagene a 500 microgrammi per millilitro in acqua distillata sterile e mescolare accuratamente. Con una pipetta di trasferimento sterile, riempire un piatto di coltura di 35 millimetri con due millilitri della soluzione di collagene diluita. Quindi inclinare leggermente il piatto e rimuovere la soluzione lasciando dietro di sé un sottile film di collagene.
Distribuire la soluzione nel prossimo piatto da 35 millimetri. Ripeti questo processo, aggiungendo più soluzione di collagene se necessario fino a quando tutti i piatti non sono stati rivestiti. Per polimerizzare il collagene, in una cappa a flusso laminare, tamponi di garza bagnati con tre millilitri di idrossido di ammonio concentrato e coprire i vassoi per 15 minuti.
Rimuovere i cuscinetti di garza e lasciare asciugare i piatti da 35 millimetri. Quindi, utilizzare un file metallico per filezzare il punto di un ago calibro 18 per creare una punta smussata. Immergere l'ago nel 70% di etanolo per sterilizzare.
Applicare grasso siliconico sul fondo della camera compartimentata. Assicurarsi che il grasso sia posizionato in modo ordinato e si sovrapponga a tutti gli angoli. Questa tecnica può essere molto impegnativa, quindi ti consigliamo di prenderti più tempo per esercitarti ad applicare la giusta quantità di grasso prima di allevare le camere compartimentate al fine di garantire un'eccellente crescita.
È anche molto importante lavorare lentamente. Imposta più camere di quelle di cui pensi di aver bisogno, quindi hai degli extra in caso di qualcosa che vada storto. Rimuovere il coperchio da un piatto da 35 millimetri, invertire il piatto e posizionare i graffi sulla camera.
Toccare delicatamente sul fondo del piatto con un paio di forcette. Quando si applicano le camere di grasso al piatto, non toccare troppo forte. Altrimenti, gli assoni non saranno in grado di crescere sotto nella camera adiacente.
Utilizzare le forcep emostatiche per capovolgere delicatamente il piatto. Rilascia le forcep. Posizionare un tumulo di grasso alla base del vano centrale.
Riempire ogni camera con mezzo basale neuronale integrato. Verificare la presenza di perdite e perdite di tenuta con grasso siliconico in base alle esigenze. Continua a assemblare tutti i piatti della cultura e conserva durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
La camera compartimentata consente l'uso di diversi reagenti farmacologici e la capacità di confrontare e confrontare i risultati tra due pozzi sulla stessa piastra. Per seminare le colture preparate contenenti una neurosfera GBM, sostituire prima il mezzo con NBF integrato contenente 10%FBS in ogni camera compartimentata distale. Successivamente, con una pipetta P20 impostata su 10 microlitri, disegnare una neurosfera GBM dal piatto di coltura.
Posizionare la punta della pipetta nella camera distale più vicina alla camera centrale senza toccare l'assone ed espellere lentamente la neurosfera GBM in modo che cada delicatamente sugli assoni. Lasciare la coltura nell'armadio della biosicurezza per un'ora a temperatura ambiente per consentire alla neurosfera GBM di attaccarsi. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per testare i composti farmacologici per il trattamento dei tumori cerebrali.
Questo metodo potrebbe essere applicato anche ad altre malattie del sistema nervoso periferico e centrale come le neuropatie demielinizzante e la sclerosi multipla. In questo protocollo, gli assoni DRG purificati sono stati seminati con HCG che formavano strutture tumorali GFAP e KI67 double positive integrate all'interno della rete assonale indicate dai marcatori tumorali rossi GFAP mentre i singoli HCG che esprimono la proteina fluorescente verde migravano in associazione o tra gli assoni. L'aggiunta di HGC sulle co-colture di oligodendrociti DRG mielinati ha mostrato che gli HGC migrano in associazione con gli assoni mielini macchiati di rosso e lontano dalla massa tumorale attraverso la formazione di pseudopodi.
Una volta perfezionata questa tecnica, siamo stati in grado di utilizzarla per studiare la migrazione delle cellule staminali GBM umane in tempo reale. Siamo stati anche in grado di studiare gli effetti sulla migrazione cellulare dopo l'aggiunta di nuovi inibitori terapeutici di piccole molecole. La sfera GBM che invade una coltura di assoni DRG oligodendrocita mielinata è mostrata qui.
Il protocollo qui descritto potrebbe servire come base per altri sistemi ex vivo tridimensionali biomimetici progettati per valutare gli effetti dei nuovi trattamenti farmacologici. Si dovrebbe sempre usare cautela quando si maneggiano cellule derivate dall'uomo. Devono essere indossati DPI appropriati e deve essere completata l'addestramento degli agenti patogeni in ematico in modo da comprendere i rischi di lavorare con tessuti derivati dal paziente.
L'idrossido di ammonio deve essere maneggiato con cura e dovresti indossare guanti, un camice da laboratorio e lavorare in un cappuccio per prevenire l'esposizione a questa sostanza chimica.
