Il nostro protocollo valuta gli effetti delle cellule soppressori derivate dal mieloide e dei macrofagi associati al tumore nell'apoptosi delle cellule tumorali indotte da cellule T. Accanto all'indagine dei meccanismi sottostanti dei potenziali interventi terapeutici. Questo protocollo valuta direttamente l'apoptosi delle cellule tumorali indotte da cellule T ad alta sensibilità e consente l'analisi longitudinale e l'imaging delle interazioni da cellula a cellula.
L'efficacia dell'inibitore del checkpoint è meglio esaminata dalle cellule mieloidi che si infiltrano nel tumore in alcuni tipi di tumore. Questa tecnica potrebbe portare all'identificazione di nuove terapie per questi tumori. Questo metodo potrebbe non solo far progredire la ricerca sull'immunologia del cancro, ma potrebbe anche fornire informazioni sull'immunodeficienza e sulle malattie autoimmuni.
Per l'attivazione e l'espansione di cellule T CD8-positive isolate con milza, prima aliquota uno per 10 alla quinta T-celle CD8-positive in 50 microlitri di E-DMEM in singoli pozzi di una piastra inferiore a U da 96 porri. Successivamente, aggiungere uno per 10 alla quinta cellule soppressore in 50 microlitri di E-DMEM, o 50 microlitri di E-DMEM da soli, in ogni pozzo di cellule T. Aggiungere quindi 50 microlitri di mezzo di attivazione appena preparato e 50 microlitri di E-DMEM, con o senza i reagenti di prova di interesse, ai pozzi appropriati.
E posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% con il 95% di umidità per quattro giorni. Per impostare una co-coltura di cellule bersaglio a cellule T cd8 positiva pre-attivata, aggiungere prima 30 microlitri di matrice di membrana basale solubile ridotta del fattore di crescita diluito da 1 a 100 ai pozzi appropriati di una piastra a fondo piatto da 96 po ', adatta per la microscopia. Agitare la piastra per stendere la matrice in modo uniforme e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per almeno un'ora.
Mentre la piastra è equilibrante, preparare le cellule bersaglio. Aspirare il mezzo, lavare con PBS e aggiungere un millilitro di 05%Tripina-EDTA a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere nove millilitri di DMEM integrati con siero bovino fetale mediante pipettazione delicata e trasferire le cellule dissociate in tubi.
Dopo aver centrifugato le celle, rimorsi il pallet in 500 microlitri di E-DMEM. Filtrare le celle rimorsiate attraverso un filtro cella e contare le celle vive. Quindi regolare la densità a quattro volte 10 alla quarta cellule bersaglio per millilitro in E-DMEM fresco sul ghiaccio.
Successivamente, pipettare le cellule T CD8-positive pre-attivate alcune volte per rimosorne le cellule in una singola sospensione cellulare e trasferire le cellule T galleggianti in un tubo da 1,5 millilitri per condizione. Raccogliere tutte le celle rimanenti con 200 microlitri di PBS per pozzo, trasferire i lavaggi nei tubi appropriati da 1,5 millilitri e centrifugare. Aspirare il mezzo e aggiungere un millilitro di E-DMEM a ciascun tubo per la centrifugazione.
Dopo la centrifugazione, resuspend i pellet in 100 microlitri di E-DMEM fresco per tubo. Dopo il conteggio, regolare le celle in ogni tubo ad una densità di 1,6 volte 10 alla quinta T-cellule CD8 positiva preattivata per millilitro di mezzo, e posizionare le cellule sul ghiaccio. Quando le cellule sono pronte, aspirare la matrice della membrana basale da ogni pozzo della piastra di microscopia a 96 po 'e aggiungere 50 microlitri di cellule bersaglio ai singoli pozzi all'interno dei 60 pozzi interni della piastra con miscelazione.
Aggiungere 25 microlitri di E-DMEM integrati con quattro volte 10 alle terze unità per millilitro di IL2 e 10-micromolare fluorogenico caspasi-3 substrato ai pozzi appropriati. Quindi aggiungere 25 microlitri di cellule T CD8-positive preattivate ai pozzi appropriati. Infine, aggiungere E-DMEM ai pozzi appropriati per realizzare un volume totale fino a 100 microlitri.
Aggiungere 200 microlitri di PBS o acqua sterile in tutti i pozzi vuoti. Agitare la piastra e lasciare la piastra su una superficie piana per 10 minuti. Per immagini le celle, impostare il microscopio per acquisire immagini in contrasto di fase.
Così come i canali di fluorescenza adatti alla proteina fluorescente a restrizioni nucleari e i fluorofori del substrato fluorogenico attivato caspasi-3 utilizzati nell'esperimento. Quindi cattura le immagini di ogni pozzo sperimentale in contrasto di fase e i due canali di fluorescenza ogni una o tre ore per almeno 72 ore. Per analizzare le immagini acquisite, aprire un'immagine da un pozzo di controllo contenente solo cellule bersaglio e mezzo senza substrato caspasi-3 nel canale di fluorescenza utilizzato per il segnale del substrato.
Osservare se i nuclei emettono un segnale di fluorescenza inappropriato. Se il segnale del substrato è evidente all'interno dei nuclei, utilizzare l'unmixing spettrale per aumentare la percentuale di segnale del substrato rimosso dal segnale dei nuclei, fino a quando il segnale del substrato scompare. Successivamente, visualizzare un pozzo di controllo contenente solo nuclei di cellule dell'effettore non etichettate in mezzo senza substrato di caspasi-3 nei due canali di fluorescenza singolarmente.
Osservare se un segnale viene emesso dai nuclei. Se nei singoli canali non è presente alcun segnale, non è necessaria alcuna unmixing spettrale. Per risolvere gli oggetti fluorescenti in entrambi i canali di fluorescenza, utilizzare un metodo di sottrazione di fondo a fluorescenza con parametri rilevanti per il campione e i parametri appropriati per la divisione dei bordi.
Utilizzare immagini della monocoltura cellulare bersaglio per stabilire parametri per la fluorescenza nucleare delle cellule bersaglio. Utilizzare immagini della monocoltura delle cellule dell'effettore per stabilire parametri per la fluorescenza nucleare apoptotica indotta dal substrato. Utilizzare immagini di co-coltura per verificare o perfezionare i parametri per la fluorescenza nucleare apoptotica indotta dal substrato nelle cellule bersaglio.
Per determinare la dimensione minima dei nuclei bersaglio, utilizzare immagini nel canale del segnale dei nuclei dai pozzi contenenti solo cellule bersaglio con substrato caspasi. Per determinare la dimensione media dei nuclei dell'effettore apoptotico, utilizzare immagini nel canale del segnale del substrato dai pozzi contenenti solo cellule effettori con substrato caspasi. Per contare il numero di nuclei cellulari bersaglio a fluorescenza, impostare una procedura di analisi utilizzando un'appropriata limitazione delle dimensioni minime.
Utilizzando immagini monocoltura di cellule effettori, impostare una seconda procedura di analisi per contare il numero di nuclei apoptotici più grandi della dimensione media dei nuclei dell'effettore apoptotico. Quindi impostare una terza procedura di analisi per contare il numero di cellule bersaglio apoptotiche contando il numero di nuclei in cui il segnale del nucleo e il segnale del substrato limitato dalle dimensioni co-localizzano in modo significativo. Tipicamente, le cellule tumorali aumentano il segnale di fluorescenza nei loro nuclei in seguito all'attivazione di un biosensore di caspasi nucleare quando le cellule vengono a contatto con cellule T cd8-positive pre-attivate dagli anticorpi in assenza di cellule soppressori.
Le dimensioni del nucleo delle cellule T positive al CD8 sono più piccole di quelle delle cellule tumorali. Pertanto, le cellule effettore apoptotiche possono essere escluse dal conteggio delle celle di destinazione apoptotiche con un metodo di analisi dell'immagine di restrizione delle dimensioni. Sebbene alcune cellule tumorali bersaglio mostrino una piccola forma arrotondata senza fluorescenza del substrato, ciò non influisce sull'analisi.
Poiché queste cellule sono sottoposte a mitosi piuttosto che apoptosi e quindi sono escluse dal conteggio delle cellule bersaglio apoptotiche da una maschera di sovrapposizione del segnale del substrato nucleare. La co-coltura delle cellule tumorali bersaglio con cellule T CD8 positive preattivate aumenta l'apoptosi delle cellule tumorali al di sopra dei livelli di apoptosi spontanea nelle monocolture delle cellule tumorali. Generalmente, quando si utilizza un rapporto ottimale tra le cellule tumorali bersaglio e le cellule di effettore, si può osservare un picco nel numero di cellule tumorali bersaglio apoptotiche.
Questo picco diventa più distinto quando i dati sono espressi come frazione apoptotica della popolazione di cellule bersaglio. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo è quello di impostare monocolture di cellule bersaglio e monocolture di cellule effettori da utilizzare nello sviluppo delle maschere di analisi. Questo metodo può fornire informazioni sulla durata e la frequenza delle interazioni tra cellule T e cellule tumorali e sulle condizioni associate alla citotossicità gene-dipendente sia nelle cellule umane che in quello del topo.
Attualmente stiamo sviluppando questo test in uno schermo ad alta produttività utilizzando cellule umane per identificare composti che inibiscono l'immunosoppressione mediata da cellule mieloidi e quindi migliorano l'efficacia dell'inibitore del checkpoint.
