Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per studiare la presenza di biomarcatore di glioma con un metodo che preserva la struttura 3D delle neurosfere tumorali. Il principale vantaggio di questo protocollo è che la morfologia delle neurosfere viene mantenuta rispetto al metodo dei citospini in cui le cellule sono sottoposte a manipolazione stressante e si appiattisce. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi altro sistema di coltura tissutale in cui le cellule sono coltivate in 3D e il mantenimento della struttura è importante.
Per cominciare, coltura di neurosfere tumorali o NS in un pallone T-25 fino a quando le cellule non sono confluenti. Eleggere l'NS tumorale in un tubo conico da 15 millilitri. Impellet l'NS a 300 G per cinque minuti.
Successivamente, sospendere il pellet in un millilitro di formalina al 10% e incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere cinque millilitri di HBSS all'NS ri-sospeso. Impellet le cellule come descritto in precedenza. Posizionare il tubo contenente il pellet sul ghiaccio.
Sospendere di nuovo il pellet NS lavato in 500 microlitri di agarosio liquido caldo al due per cento. E mescolare con una tubazione delicata o mescolando. Posizionare l'Agarosio incorporato NS sul ghiaccio fino a quando l'agarosio polimerizza.
Quindi rimuovere il pezzo di agarosio, tenendo l'NS. Posizionare il pezzo di agarosio in una cassetta per la lavorazione dei tessuti. Impostare un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius. E inserire con cura la lama nel microtomo.
Quindi posizionare il blocco di paraffina nel microtomo. Con una mano, premere verso il basso sulla leva che controlla lo spessore di ogni sezione situata sul lato sinistro della macchina. Premere la leva fino al secondo arresto per impostare il microtomo su uno spessore di 30 micrometri.
Ruotare il volantino grossolano per iniziare a tagliare il blocco. Una volta che la superficie del campione è quasi esposta, impostare la leva che controlla lo spessore a cinque o 10 micrometri. Interrompere il taglio quando viene raggiunta la superficie del campione.
Riempire una ghiacciaia con ghiaccio e acqua sufficiente per proteggere il blocco di paraffina dal toccare direttamente il ghiaccio. Scartare la vecchia lama del microtomo e inserirne una nuova per la sessatura. Asciugare il blocco di paraffina con garza e posizionarlo sul microtomo.
Ruotare la ruota a mano grossolana per iniziare a sessare la paraffina. Quindi utilizzare un pennello umido per trasferire il nastro di paraffina al bagno d'acqua di 42 gradi Celsius. Utilizzando la curva delle forcep, posizionare le forcep tra due sezioni di paraffina e allontanare delicatamente le sezioni.
Utilizzare il pennello umido per spingere le sezioni separate su vetrini del microscopio ad adesione caricati positivamente. In primo luogo, sciogliere la paraffina incubando gli scivoli in un rack metallico a 60 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi deparaffinizzare le diapositive tramite incubazione in un treno di reidratazione a temperatura ambiente secondo il protocollo di testo.
Conservare i vetrini nell'acqua del rubinetto per evitare il legame anticorpale non specifico. Successivamente, incubare le diapositive in tampone di citrato a 125 gradi Celsius per 30 secondi e 90 gradi Celsius per 10 secondi. Lasciare raffreddare i vetrini prima di risciacquarli cinque volte con acqua distillata.
Successivamente, incubare i vetrini a temperatura ambiente in perossido di idrogeno allo 0,3% per 20 minuti. Quindi, lavare gli scivoli per cinque minuti, tre volte in tampone di lavaggio con delicata agitazione. Incubare i vetrini durante la notte in una camera umidificata impostata a quattro gradi Celsius con anticorpo primario diluito.
Dopo questo, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti con delicata agitazione. Successivamente, incubare le diapositive in anticorpi secondari biotinilati diluiti a temperatura ambiente per un'ora. Lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti in tampone di lavaggio con delicata agitazione.
Quindi, incubare gli scivoli nel complesso perossidasi del rafano biotinilato di avidina a temperatura ambiente al buio per un'ora. Ripetere il lavaggio come descritto in precedenza. Successivamente, incubare le diapositive con le marche di substrato di perossido di idrogeno DAB per due o cinque minuti a temperatura ambiente.
Risciacquare gli scivoli con acqua del rubinetto e immergere gli scivoli in soluzione di ematossilina per controbilanciarli. Quindi sciacquare accuratamente gli scivoli nell'acqua del rubinetto fino a quando l'acqua non scorre limpida. Disidratare le diapositive in base al protocollo di testo.
Infine, coprire le diapositive con un mezzo di montaggio a base di xilene e consentire loro di asciugare su una superficie piana a temperatura ambiente. In questo protocollo, gli NS sono fissi e incorporati in agarosio e paraffina. E poi sono macchiati per specifici biomarcatori di glioma.
Il livello di espressione di ATRX, una proteina chaperone che media la struttura della cromatina, è basso. Ki67, un biomarcatore della proliferazione cellulare, è positivo nel glioma NS. Infine, gli NS sono positivi anche per OLIG2, un fattore di trascrizione che media la differenziazione degli oligodendrociti. La cosa più importante da ricordare è sospendere di nuovo bene le cellule nell'agarosio caldo prima di trasferirsi sul ghiaccio, per garantire una distribuzione uniforme delle neurosfere.
