Il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare il potenziale angiogenico dei neutrofili primari associati al tumore in vivo senza la necessità di utilizzare modelli di linea cellulare neutrofili artificiali. L'inibizione diretta della nicotinammide fosforibosiltransferasi, a breve NAMPT, nei neutrofili associati al tumore con il loro successivo trasferimento adottivo in animali portanti di tumore consente la manipolazione di neutrofili senza effetti collaterali tossici sistemici. Dimostreremo il potenziale terapeutico dei neutrofili manipolati anti-angiogenici associati al tumore dopo il trasferimento in ospiti portanti di tumore per lo studio di potenziali immunoterapie a base di neutrofili in diversi modelli di cancro.
Per impostare un modello di topo tumorale allogenico, radere la pelle da 10 a 12 settimane femmina interferone alfa e beta-recettore subunità 1 topo knockout con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con 70%etanolo, quindi caricare tre volte 10 alle sei cellule di melanoma B16F10 per millilitro di PBS in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 0,4 per 19 millimetri e iniettare 100 microlitri della sospensione per via sottocutanea su un fianco posteriore in ogni rasato Animale. Per il trasferimento neutrofilo-adottivo, diluire le cellule di melanoma B16F10 a sei per 10 alla sesta concentrazione di millilitro in PBS e diluire i neutrofili trattati con inibitore NAMPT FK866 a sei per 10 alla quinta cella per millilitro di concentrazione di PBS. Quindi, mescolare neutrofili non trattati o trattati con inibitori con le cellule del melanoma con un rapporto neutrofilo-tumore di 1:10 e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri di cellule in un massimo di cinque topi per gruppo.
Dopo le iniezioni, posizionare fino a cinque topi femmine iniettati in una singola gabbia e utilizzare pinze per misurare la lunghezza, la larghezza e la profondità del tumore ogni giorno per 14 giorni. Al giorno 14 dopo l'iniezione, disinfettare la pelle di ogni animale iniettato con il 70% di etanolo e utilizzare forbici e forcep per raccogliere i tumori in un tubo conico da 50 millilitri contenente mezzo completo sul ghiaccio. Per sessare i tumori per l'analisi istologica, immergere i tumori in un composto ottimale della temperatura di taglio e congelare i campioni in azoto liquido per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.
Il giorno della sessatura, scongelare i campioni a meno 20 gradi Celsius prima di utilizzare un criotomo per ottenere sezioni di cinque micrometri. Dopo la fissazione in legame non specifico, macchiare le sezioni del tessuto tumorale con gli anticorpi primari di interesse per un'ora a 20 gradi Celsius, seguiti da tre lavaggi in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, macchiare le cellule con un anticorpo secondario coniugato a fluorescenza appropriato in un colorante di colorazione nucleare come DAPI per un'ora a 20 gradi Celsius protetto dalla luce.
Al termine dell'incubazione, asciugare i vetrini per 20 minuti a 20 gradi Celsius protetti dalla luce prima di montare i campioni con un mezzo di montaggio anidro, quindi coprire ogni diapositiva con uno scivolo di copertura e lasciare asciugare il supporto di montaggio per un'ora a 37 gradi Celsius prima di periferico i tessuti mediante microscopia a fluorescenza. Per l'isolamento neutrofilo associato al tumore, posizionare cinque tumori per pozzo in singoli pozzi di una piastra sterile a sei pozzi mentre vengono raccolti e utilizzare forbici sterili per tritare i tumori in pezzi da due a tre millimetri. Successivamente, digerire i frammenti tumorali con un millilitro di collagenasi d dnasi 1 soluzione per 45 minuti a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con umidità, mescolando i campioni con una siringa da 10 millilitri ogni 15 minuti.
Al termine dell'incubazione, filtrare le cellule attraverso filtri da 100 micrometri in un tubo da 15 millilitri per pozzo per rimuovere le fibre non digerite e aggiungere PBS a un volume finale di 15 millilitri. Raccogliere le cellule dissociate per centrifugazione e lisciviare i globuli rossi con un millilitro di tampone di lisi per tubo. Dopo la miscelazione, unire il contenuto di ogni tubo in un singolo tubo da 15 millilitri, fermando la reazione dopo due minuti con 11 millilitri di mezzo completo di quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, rimescolare il pellet in un millilitro di PBS e bloccare qualsiasi legame non specifico con tre microlitri di anticorpo Fc-block per 15 minuti sul ghiaccio. Al termine dell'incubazione, etichettare le cellule con anticorpi anti-CD11b e Ly6G e qualsiasi altro anticorpo di interesse, più DAPI, per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 14 millilitri di PBS e rimosogliere i pellet a una volta per 10 alla settima cellule per millilitro di concentrazione media completa fresca sul ghiaccio, quindi ordinare i neutrofili CD11b-positivi, Ly6G, ad alto DAPI-negativi su uno smistatore di celle attivato dalla fluorescenza secondo protocolli di smistamento standard, controllando la purezza dei neutrofili isolati sul citometro di flusso alla fine del tipo.
Per l'inibizione neutrofila associata al tumore in vitro, seme 1,5 per 10 al quinto neutrofilo ordinato in ciascuno dei due pozzi di una piastra inferiore a U di 96 po 'e aggiungere FK866 a una concentrazione finale di 100 nanomolari in mezzo completo in un pozzo e un volume uguale di mezzo completo da solo all'altro pozzo. Dopo due ore nell'incubatore di coltura cellulare, lavare le cellule due volte con PBS e rimosogliere i pellet in PBS alla concentrazione appropriata per la successiva iniezione. I neutrofili trattati con NAMPT-inibitore hanno una capacità significativamente ridotta di stimolare la formazione di rami aortici rispetto alle cellule non trattate.
Inoltre, l'iniezione sottocutanea di neutrofili anti-angiogenici trattati con inibitori induce una significativa compromissione della crescita tumorale rispetto ai topi iniettati con neutrofili knockout alfa interferone non trattato e subunità del recettore beta 1. L'esame istologico dei tumori estratti conferma inoltre la significativa soppressione dell'angiogenesi nei tumori isolati dai topi trattati con neutrofili associati al tumore trattati con inibitori rispetto a quelli iniettati con neutrofili knockout non trattati. Per valutare le proprietà dei neutrofili associati al tumore trattati con FK866, è possibile eseguire PCR quantitativo e Western Blot per studiare l'attivazione di vie intracellulari coinvolte nella polarizzazione neutrofila.
Poiché i neutrofili hanno vita breve, è necessario eseguire tutti i passaggi il più rapidamente possibile e mantenere freddi i neutrofili durante l'intera procedura. Questa tecnica apre la strada allo studio dei meccanismi intracellulari e dei fattori coinvolti nella regolazione delle proprietà angiogeniche e tumorigeniche dei neutrofili associati al tumore in vivo.
