Protokolümüz, yapay nötrofil hücre serisi modelleri kullanmaya gerek kalmadan in vivo in tümörilişkili primer nötrofillerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için yeni bir araç sağlamaktadır. Nikotinamid fosforibosiltransferaz doğrudan inhibisyonu, kısaca NAMPT, tümör taşıyan hayvanlara sonraki benimseyen transferi ile tümör ilişkili nötrofiller sistemik toksik yan etkileri olmadan nötrofillerin manipülasyon sağlar. Farklı kanser modellerinde potansiyel nötrofil bazlı immünoterapilerin incelenmesi için tümör taşıyan konaklara geçtikten sonra manipüle edilen anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofillerin terapötik potansiyelini göstereceğiz.
Allojenik tümör fare modeli kurmak için, 10-12 haftalık dişi interferon alfa ve beta-reseptör alt ünitesi 1 nakavt farelerin derisini elektrikli tıraş makineli olarak tıraş edin ve cildi %70 etanol ile dezenfekte edin, sonra pbs mililitre başına altı B16F10 melanom hücrelerine üç kez yükleyin bir mililitre şırınga bir mililitre şırınga ile donatılmış bir mililitre lik iğne ile 0.4 tarafından 19 milimetrelik iğne ve her tıraş içine bir arka kanadında süspansiyon subkutan 100 mikrolitre enjekte Hayvan. Nötrofil-benimseyen transfer için, PBS mililitre konsantrasyonu başına altı kez 10 B16F10 melanom hücreleri seyreltmek ve seyreltik nötrofiller NAMPT inhibitörü FK866 ile tedavi altı kez 10 PBS konsantrasyonu mililitre başına beşinci hücrelere. Daha sonra, tedavi edilmeyen veya inhibitör le tedavi edilen nötrofilleri 1:10 nötrofil-tümör oranında melanom hücreleriyle karıştırın ve deri altı 100 mikrolitre hücreyi grup başına en fazla beş fareye enjekte edin.
Enjeksiyonlardan sonra, tek bir kafese beş kadar enjekte edilen dişi fare yerleştirin ve 14 gün boyunca her gün tümör uzunluğunu, genişliğini ve derinliğini ölçmek için kaliper kullanın. Enjeksiyondan sonra 14. Histolojik analiz için tümörleri kesmek için, tümörleri optimum kesme sıcaklığı bileşiğinde batırın ve eksi 80 santigrat derecede depolanması için numuneleri sıvı nitrojenle dondurun.
Kesit günü, beş mikrometrelik kesitler elde etmek için bir kriyotom kullanmadan önce örnekleri eksi 20 santigrat dereceye kadar eritin. Spesifik olmayan bağlamafikse fiksasyonsonra, 20 santigrat derece ilgi birincil antikorlar ile tümör doku bölümleri leke, PBS üç yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, 20 santigrat derece ışıktan korunan bir saat boyunca DAPI gibi nükleer boyama boya uygun floresan konsültonlu ikincil antikor ile hücreleri leke.
Kuluçka sonunda, 20 derece santigrat bir susuz montaj ortamı ile örnekleri monte etmeden önce ışıktan korunan 20 dakika slaytlar kuru, sonra bir kapak kayma ile her slayt kapağı ve floresan mikroskop ile dokuları görüntülemeden önce 37 santigrat derece bir saat kurumasını montaj ortamı sağlar. Tümörilişkili nötrofil izolasyoniçin, onlar hasat ve iki ila üç milimetrelik parçalar halinde tümörleri kıyma steril makas kullanmak gibi steril altı kuyu plaka bireysel kuyular içine iyi başına beş tümör yerleştirin. Daha sonra, bir mililitre dispase kollajenaz d dnase 1 çözeltisi ile tümör parçalarını sindirin ve 37 santigrat derecede nem oranı %5 karbondioksitte 45 dakika boyunca 10 mililitrelik şırınga ile numuneleri 15 dakikada bir karıştırın.
Kuluçka sonunda, sindirilmemiş lifleri kaldırmak ve 15 mililitrelik son bir hacme PBS eklemek için iyi başına 15 mililitrelik bir tüp içine 100 mikrometre süzgeçler aracılığıyla hücreleri filtreleyin. Ayrık hücreleri santrifüj ile toplayın ve tüp başına bir mililitre lysis tampon ile kırmızı kan hücrelerini lyse. Karıştırma sonra, tek bir 15 mililitrelik tüp içine her tüp içeriğini birleştirmek, tam dört derece santigrat orta 11 mililitre ile iki dakika sonra reaksiyon durdurma.
Santrifüjden sonra, pbs bir mililitre pelet resuspend ve buz üzerinde 15 dakika fc-blok antikor üç mikrolitre ile herhangi bir non-spesifik bağlama blok. Kuluçka sonunda, hücreleri anti-CD11b ve Ly6G antikorları ve diğer ilgi antikorları ve daPI ile etiketleyin. Kuluçka sonunda, pbs 14 mililitre hücreleri yıkayın ve bir kez 10 buz taze tam orta konsantrasyon mililitre başına yedinci hücrelere pelet askıya, sonra CD11b-pozitif, Ly6G, yüksek DAPI-negatif nötrofiller bir floresan-aktive hücre ayırıcı standart sıralama protokollerine göre, tür sonunda akış sitometre üzerinde izole nötrofillersaflığını kontrol sıralamak.
In vitro tümör ilişkili nötrofil inhibisyonu için, tohum 1.5 kez 10 beşinci sıralanmış nötrofil ler için 96-iyi U-alt plaka iki kuyuher içine ve fk866 eklemek 100 nanomolar bir kuyu içine tam ortamda son konsantrasyon ve diğer kuyuya tek başına tam orta eşit hacimli. Hücre kültürü kuluçka iki saat sonra, PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve sonraki enjeksiyon için uygun konsantrasyonda PBS pelet resuspend. NAMPT inhibitörü tedavi nötrofiller tedavi edilmeyen hücrelere göre aort dal oluşumunu uyarmak için önemli ölçüde azalmış kapasiteye sahiptir.
Buna ek olarak, inhibitör tedavi anti-anjiyojenik nötrofillerin deri altı enjeksiyonu tedavi edilmemiş interferon alfa ve beta reseptör alt ünitesi 1 nakavt nötrofil enjekte farelere göre tümör büyümesinde önemli bir bozulmaya neden olur. Çıkarılan tümörlerin histolojik incelemesi, tedavi edilmeyen nakavt nötrofilleri ile karşılaştırıldığında inhibitör tedavi edilen tümör ilişkili nötrofillerle tedavi edilen farelerden izole edilen tümörlerde anjiyogenezin önemli ölçüde bastırıldığını da doğrulamaktadır. FK866-tedavi edilen tümör ilişkili nötrofillerin özelliklerini değerlendirmek için nötrofil polarizasyonunda yer alan hücre içi yolların aktivasyonunu incelemek için kantitatif PCR ve Batı Blot'u yapılabilir.
Nötrofiller kısa ömürlü olduğundan, tüm adımları mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirmek ve tüm işlem boyunca nötrofiller soğuk tutmak için gereklidir. Bu teknik, in vivo in tümörilişkili nötrofillerin anjiojenik ve tümörijenik özelliklerinin düzenlenmesinde rol oynayan hücre içi mekanizmalar ve faktörlerin incelenmesinin önünü açar.
