Nosso protocolo fornece uma nova ferramenta para avaliar o potencial angiogênico de neutrófilos primários associados ao tumor in vivo sem a necessidade de usar modelos de linha de células neutrófilas artificiais. A inibição direta da nicotinamida fosphoribosyltransferase, logo NAMPT, em neutrófilos associados ao tumor com sua subsequente transferência adotiva para animais portadores de tumores permite a manipulação de neutrófilos sem efeitos colaterais tóxicos sistêmicos. Demonstraremos o potencial terapêutico de neutrófilos anti-angiogênicos manipulados associados a tumores após a transferência para hospedeiros portadores de tumores para o estudo de potenciais imunoterapias à base de neutrófilos em diferentes modelos de câncer.
Para configurar um modelo de camundongo tumoral alogênico, raspe a pele de 10 de 8 a 12 semanas de idade, interferon alfa e subunidade beta-receptor 1 camundongos com um barbeador elétrico e desinfete a pele com 70% de etanol, em seguida, carregar três vezes 10 para as seis células de melanoma B16F10 por mililitro de PBS em uma seringa de um mililitro equipado com uma agulha de 0,4 por 19 milímetros e injetar 100 microlitadores da suspensão subcutânea em um flanco traseiro em cada raspado Animal. Para transferência adotiva de neutrófilo, diluir as células de melanoma B16F10 para seis vezes 10 a sexta células por concentração de mililitro em PBS e diluir os neutrófilos tratados com inibidor de NAMPT FK866 para seis vezes 10 a cinco células por mililitro de concentração de PBS. Em seguida, misture neutrófilos não tratados ou inibidores com as células de melanoma a uma relação neutrófilo-tumor de 1:10 e injete subcutânea 100 microliters de células em até cinco camundongos por grupo.
Após as injeções, coloque até cinco camundongos fêmeas injetados em uma única gaiola e use pinças para medir o comprimento, largura e profundidade do tumor todos os dias durante 14 dias. No dia 14 após a injeção, desinfete a pele de cada animal injetado com 70% de etanol e use tesouras e fórceps para colher os tumores em um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio completo no gelo. Para seção dos tumores para análise histológica, submergir os tumores em um composto de temperatura de corte ideal e congelar as amostras em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius.
No dia da secção, descongele as amostras a menos 20 graus Celsius antes de usar um criotome para obter seções de cinco micrômetros. Após fixação em ligação não específica, colori a repertramento das seções de tecido tumoral com os anticorpos primários de interesse por uma hora a 20 graus Celsius, seguida por três lavagens em PBS. Após a última lavagem, manche as células com um anticorpo secundário conjugado pela fluorescência em um corante de coloração nuclear como DAPI por uma hora a 20 graus Celsius protegido da luz.
Ao final da incubação, seque os slides por 20 minutos a 20 graus Celsius protegidos da luz antes de montar as amostras com um meio de montagem anidro, em seguida, cubra cada slide com um deslizamento de cobertura e deixe o meio de montagem secar por uma hora a 37 graus Celsius antes de imaginar os tecidos por microscopia de fluorescência. Para o isolamento neutrófilo associado ao tumor, coloque cinco tumores por poço em poços individuais de uma placa de seis poços estéreis à medida que são colhidos e usem uma tesoura estéril para picar os tumores em pedaços de dois a três milímetros. Em seguida, digerir os fragmentos tumorais com um mililitro de colagenase d dnase 1 solução por 45 minutos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono com umidade, misturando as amostras com uma seringa de 10 mililitros a cada 15 minutos.
No final da incubação, filtre as células através de filtros de 100 micrômetros em um tubo de 15 mililitros por poço para remover as fibras não digeridas e adicionar PBS a um volume final de 15 mililitros. Colete as células dissociadas por centrifugação e lise os glóbulos vermelhos com um mililitro de tampão de lise por tubo. Após a mistura, misture o conteúdo de cada tubo em um único tubo de 15 mililitros, interrompendo a reação após dois minutos com 11 mililitros de meio Celsius completo de quatro graus.
Após a centrifugação, resuspenja a pelota em um mililitro de PBS e bloqueie qualquer ligação não específica com três microliters de anticorpo fc-block por 15 minutos no gelo. No final da incubação, rotule as células com anticorpos anti-CD11b e Ly6G e quaisquer outros anticorpos de interesse, além de DAPI, para uma incubação de 30 minutos no gelo protegido da luz. No final da incubação, lave as células em 14 mililitros de PBS e resuspenja as pelotas em uma única vez 10 a 7 células por mililitro de concentração média completa fresca no gelo, então classifique o CD11b positivo, Ly6G, nêutrons onífilos onífilos onírgicos ativados pela fluorescência em um classificador celular ativado pela fluorescência de acordo com protocolos de classificação padrão, verificando a pureza dos neutrófilos isolados no citómetro de fluxo no final do tipo.
Para inibição de neutrófilo in vitro associado a tumores, sementes 1,5 vezes 10 para o quinto neutrófilos classificados em cada um dos dois poços de uma placa de fundo U de 96 poços e adicionar FK866 a uma concentração final de 100 nanomolar em meio completo em um poço e um volume igual de meio completo sozinho para o outro poço. Após duas horas na incubadora de cultura celular, lave as células duas vezes com PBS e resuspenja as pelotas em PBS na concentração apropriada para a injeção subsequente. Os neutrófilos tratados com inibidores do NAMPT têm uma capacidade significativamente reduzida para estimular a formação de ramos aórticos em comparação com células não tratadas.
Além disso, a injeção subcutânea de neutrófilos anti-angiogênicos tratados com inibidores induz um prejuízo significativo no crescimento do tumor em comparação com camundongos injetados com interferon alfa não tratado e subunidade do receptor beta 1 neutrófilos eliminatórios. O exame histológico dos tumores extraídos confirma ainda a supressão significativa da angiogênese em tumores isolados de camundongos tratados com neutrófilos associados ao tumor inibidor em comparação com aqueles injetados com neutrófilos não tratados. Para avaliar as propriedades dos neutrófilos associados ao tumor tratado por FK866, o PCR quantitativo e a Mancha Ocidental podem ser realizados para estudar a ativação de vias intracelulares envolvidas na polarização de neutrófilos.
Uma vez que os neutrófilos são de curta duração, é necessário realizar todas as etapas o mais rápido possível e manter os neutrófilos frios durante todo o procedimento. Essa técnica abre caminho para o estudo dos mecanismos e fatores intracelulares envolvidos na regulação das propriedades angiogênicas e tumorigênicas dos neutrófilos associados ao tumor in vivo.
