Descriviamo qui un semplice flusso di lavoro basato su Fiji opensource chiamato Worm-align, che può essere utilizzato per generare montaggi a canale singolo o multicanale di worm raddrizzati di interesse da immagini di microscopia grezze. Poiché questo flusso di lavoro si basa su animali di interesse selezionati dall'utente, potrebbe essere particolarmente utile quando si analizzano immagini da C.elegans in cui i worm non sono tutti nella fase o condizione corretta. Va notato che l'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione della fluorescenza con Fiji o altri software di analisi delle immagini.
Qui dimostriamo la quantificazione della fluorescenza utilizzando la pipeline CellProfiler Worm_CP. Inizia creando una micropipetta per la bocca estendendo un sottile capillare di vetro nella fiamma di un bruciatore Bunsen. Dopo l'estensione nella fiamma, rompere il capillare in due pezzi se non si è rotto in due pezzi dopo l'estensione.
Se si è rotto in due pezzi, tagliare l'estremità di quello più lungo. Selezionare il pezzo più lungo e verificare se il capillare è aperto tentando di aspirare l'acqua. Staccare l'adattatore da un tubo in silicone da tre millimetri.
Collegare il capillare di vetro a un adattatore capillare collegato a un tubo di silicone di sei millimetri. Quindi collegare l'altra estremità del tubo di sei millimetri a un filtro da 0,2 micrometri e un tubo di silicone di tre millimetri sull'altra estremità. Collegare una punta del filtro di un millimetro all'estremità libera del tubo in silicone da tre millimetri per aspirare il liquido.
Al microscopio a dissezione, rimuovere il più liquido possibile intorno a un pellet di vermi fissi con la micropipetta della bocca. Aggiungere rapidamente 10 microlitri di mezzo di montaggio sul fondo del tubo. Risciacquare una punta da 10 microliter in PBS con tracce di detergente per evitare che i vermi si attacchino ai lati della punta della pipetta di plastica.
Quindi tagliare l'estremità della punta con un paio di forbici. Trasferire otto microlitri di mezzo di montaggio con i vermi su un cuscinetto di agarosio precedentemente preparato. Osservando lo scivolo al microscopio, agitarlo delicatamente per evitare sovrapposizioni dei vermi.
Quindi coprire la goccia di mezzo di montaggio sul tampone di agarosio con un coverslip da 18 per 18 millimetri. Per montare vermi vivi, pipetta da tre a quattro microlitri di levamisolo millimolare sciolti in M9 su un cuscinetto di agarosio. Scegli da 30 a 50 vermi per condizione nella goccia di levamisolo.
Quindi coprire la goccia con un coverslip di 18 per 18 millimetri e immagini i vermi entro un'ora. Installare il pacchetto software di analisi delle immagini open source Fiji da ImageJ, o se è già installato nel computer, verificare che sia versione 1.52A o successiva, quindi scaricare il repository worm-align da GitHub e salvarlo sul computer. Una volta scaricati e installati tutti i componenti della pipeline, aprire Fiji ed eseguire la macro Di allineamento worm facendo clic su plug-in, macro ed esecuzione nella barra dei menu principale.
Individuare l'allineamento del verme. script ijm e fare clic su apri. Passare alla cartella di input con le immagini da analizzare e fare clic su seleziona, assicurandosi che la cartella selezionata contenga solo file di immagine.
La macro genererà automaticamente una cartella di output in cui verranno salvati tutti i risultati. Il nome della cartella sarà lo stesso della cartella di input con l'output come post-correzione. Consentire alla macro di aprire la prima immagine nella cartella di input e usarla come immagine rappresentativa per estrarre le impostazioni necessarie per generare il montaggio, inclusa la larghezza dei worm, la luminosità e il contrasto.
Utilizzando lo strumento di disegno a linea retta, disegnare una linea sulla larghezza di un worm e fare clic su OK. Utilizzare la lunghezza di questa linea per determinare l'altezza delle aree ritagliate per i singoli worm. Per ogni canale, specificare il nome, la tabella di ricerca e se deve essere inclusa nel montaggio, quindi fare clic su OK. Quindi, regola le impostazioni di luminosità e contrasto per i canali usando i dispositivi di scorrimento. Ripetere questo processo per i canali rimanenti.
Una volta configurate tutte le impostazioni, verranno registrate in una tabella delle impostazioni e salvate nella sottocartella CellProfiler della cartella di output. Viene generata un'immagine per mostrare come saranno tutte le immagini dopo l'applicazione delle impostazioni. Se l'immagine è soddisfacente, spuntare la casella superiore.
La seconda e la terza casella del pannello seleziona tutte le impostazioni specificano le opzioni per la generazione del montaggio. Lasciare entrambe le caselle selezionate e fare clic su OK per eseguire il resto della macro. Se non si seleziona la casella superiore, la macro verrà rieseguita.
La macro procede quindi ad aprire tutte le immagini nella cartella di input. Per ogni immagine, disegnare linee sull'asse longitudinale di tutti i worm da includere nel montaggio utilizzando lo strumento linea segmentata o a mano libera. Disegnare le linee in modo coerente da testa a coda o viceversa lungo l'intera lunghezza dei worm e aggiungere ogni riga al gestore del ROI facendo clic su Controllo T.Una volta aggiunti tutti i worm desiderati, fare clic su OK. L'allineamento del worm genererà quindi immagini ritagliate di singoli worm selezionati, che verranno salvati nella singola sottocartella worm della cartella di output.
I montaggi di tutti i worm selezionati verranno salvati nella cartella allineata. Scaricare e installare CellProfiler 2.2.0 facendo clic sul collegamento per le versioni precedenti di CellProfiler nella pagina di download e selezionando il sistema operativo richiesto. Prima di avviare Worm_CP pipeline, assicurarsi che tutte le immagini di output previste siano presenti nella sottocartella CellProfiler della cartella di output di worm-align.
Una copia elaborata dell'immagine originale, una maschera immagine binaria della popolazione di worm, allinea la maschera se la linea viene disegnata su worm selezionati e deve essere presente un'immagine che rappresenta ciascuno dei canali nell'immagine originale. Aprire CellProfiler, quindi fare clic sul modulo di input delle immagini e trascinare la cartella del modulo CellProfiler nella finestra in cui sono presenti file e cartelle di rilascio. Se un elenco di immagini è presente da un'analisi precedente, rimuoverle facendo clic con il pulsante destro del mouse nella finestra e selezionando cancella elenco file.
Fare clic sul modulo di input dei metadati e sul secondo metodo di estrazione fare clic sulla cartella gialla e passare alla sottocartella CellProfiler della cartella di output Di allineamento worm. Selezionare il file delle impostazioni e quindi fare clic su Aggiorna. Fare quindi clic sul modulo di input nomi e tipi e verificare che siano presenti tutte le immagini necessarie per la pipeline.
Prima di eseguire la pipeline, selezionare una destinazione per i risultati dell'output nel modulo di output. Utilizzare la modalità di test per vedere le prestazioni della pipeline facendo clic sulla modalità di test iniziale e consentirgli di eseguire la prima immagine nella cartella. Se soddisfatto delle prestazioni della pipeline, fare clic sulla modalità di test di uscita e analizzare le immagini.
Prima di iniziare l'analisi, assicurarsi che tutti gli occhi davanti al modulo di analisi siano chiusi. Al termine dell'analisi, aprire Worm_CP cartella di output costituita da due file CSV, worm CSV e righe CSV. La coltivazione e l'imaging di C.elegans secondo il metodo descritto in questo protocollo produce immagini di grandi dimensioni sulle popolazioni di worm.
L'output della pipeline dipende in gran parte dalla qualità delle linee disegnate sopra le immagini. Diversi esempi di linee e il loro output da Worm-align sono mostrati qui. Quando si utilizza lo script di allineamento worm, è possibile l'identificazione visiva dei worm intersecati dalle immagini sovrapposte presenti nella sottocartella dei dati, nonché dai pannelli dei singoli worm nel montaggio.
La tabella QC può anche essere utilizzata per identificare i worm sovrapposti. Tuttavia, le linee intersecante sono problematiche per la Worm_CP pipeline. Questo perché il Worm_CP la maschera di linea, non le regioni di interesse, per aiutare a identificare i singoli worm.
Pertanto, CellProfiler segmenterà uno dei worm come due oggetti. La Worm_CP è stata utilizzata per quantificare l'intensità della fluorescenza da animali fissi etichettati con un colorante fluorescente che incorpora nelle goccioline lipidiche. Il contenuto di goccioline lipidiche è diminuito del 17% tra gli animali di tipo selvatico e mutante DBL1 utilizzando la quantificazione manuale e del 12% utilizzando la pipeline Worm_CP animale.
Worm_CP è stato anche usato per quantificare la risposta agli shock termici nei vermi vivi che esprimono la GFP sotto il controllo di un gene inducibile da shock termico. In assenza di stress da calore, i vermi non hanno indotto l'espressione della GFP. Quando i vermi sono esposti come un breve shock termico, viene indotta l'espressione GFP.
L'output Worm_CP dipende in gran parte dalla qualità delle linee disegnate utilizzando l'allineamento worm. Assicurarsi che le linee non si tocchino o si sovrappongano e disegnare tutte le linee nella stessa direzione. Il controllo della tabella QC consente di identificare le linee che si toccano o si sovrappongono in modo da poter escludere tali casi dall'analisi.
L'output di Worm-align può essere utilizzato per la successiva quantificazione sia nelle Fiji che in altri pacchetti software di analisi delle immagini. Abbiamo mostrato qui una pipeline cellprofiler molto semplice in cui altri moduli di analisi potrebbero essere facilmente incorporati, ad esempio, per contare il numero di goccioline lipidiche o per quantificare l'intensità delle singole goccioline all'interno di un verme. Uno dei vantaggi di questa tecnica è la possibilità di quantificare rapidamente la fluorescenza dai singoli vermi.
Nel nostro laboratorio, abbiamo interesse alla fattibilità individuale utilizzando giornalisti a fluorescenza e usiamo worm-align e Worm_CP abitualmente per questo scopo.
