Hai mai pensato di sfruttare il potere della microdisezione di cattura laser per l'analisi dell'espressione genica in specifiche cellule ossee all'interno del loro ambiente naturale? Qui descriviamo un protocollo che ti permetterà di ottenere quantità sufficienti di RNA di alta qualità dalle criosezioni delle ossa del topo. Questa tecnologia è un ottimo strumento per esaminare i cambiamenti nell'espressione genica in specifiche cellule ossee in modelli di topi geneticamente modificati o in modelli di malattia.
Il protocollo qui descritto è focalizzato sulle ossa del topo, ma può essere utilizzato per studiare in situ un'espressione genica nelle cellule di qualsiasi tessuto duro in qualsiasi specie. Ad aiutare a dimostrare questa procedura, sarà Christiane Schueler, una tecnico del mio laboratorio. Dopo aver eutanasiato i topi per esanguineità in anestesia generale, rimuovere rapidamente interi femore.
Utilizzare un bisturi e tovaglioli di carta per pulire i femminicidi dei tessuti molli circostanti. Quindi, versare il composto ottimale della temperatura di taglio nello stampo di incorporamento e posizionare i femuri nella parte inferiore degli stampi di incorporamento. Snap congelare i campioni in azoto liquido.
Una volta che i campioni sono completamente congelati, avvolgerli in un foglio e trasferirli sul ghiaccio secco in un congelatore. Conservarli a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per un'ulteriore elaborazione. In primo luogo, impostare la temperatura nel criostato su meno 19 gradi Celsius e la temperatura del supporto del blocco a meno 17 gradi Celsius.
Quindi, pulire l'interno del criostato con il 70% di etanolo. Posizionare la lama monouso per i tessuti duri, i vetrini e uno strumento di montaggio nel criostato per raffreddarli e tenerli all'interno del criostato per tutta la durata del seghettamento. Trasferire il blocco di tessuto congelato sul ghiaccio secco al criostato e consentirgli di equilibrare per almeno 10 minuti.
Quindi, premere la parte inferiore dello stampo di incorporamento per spingere il blocco OCT fuori dalla muffa. Applicare un mezzo di strumento di personalizzazione di Office sufficiente al supporto del blocco per aderire al blocco e attendere che il supporto dello Strumento di personalizzazione di Office si blocchi completamente. Successivamente, posizionare il supporto del blocco nel supporto dell'oggetto e stringerlo in posizione.
Regolare la posizione della lama e tagliare il blocco con incrementi di taglio di 15 micrometri per rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office che copre il campione. Regolare il criostato per generare sezioni di otto micrometri e tagliare da due a tre criosezioni che verranno scartate. Posizionare la pellicola adesiva sul blocco e utilizzare lo strumento di montaggio per aderire alla pellicola al blocco.
Ora, fai un taglio lentamente e a velocità costante, tenendo la sezione vicino al film. Posizionare il film con il campione rivolto verso l'alto su uno scivolo di vetro pre-raffreddato sulla criobara all'interno del criostato per evitare lo scongelamento del campione. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la pellicola allo scivolo di vetro per una colorazione più semplice.
In una cappa aspirante, preparare le soluzioni necessarie di etanolo, acqua priva di RNasi e xilene sul ghiaccio come delineato nel protocollo di testo. Incubare le sezioni con il 95% di etanolo per 30 secondi. Quindi, immergere con cura le sezioni in acqua priva di RNasi per 30 secondi per rimuovere completamente lo Strumento di personalizzazione di Office.
Successivamente, erogare 50 microlitri di macchia commerciale di sezione congelata LCM sulla sezione e incubare a temperatura ambiente per 10 secondi. Scolare la sezione posizionando il bordo dello scivolo su carta velina assorbente. Risciacquare la sezione in etanolo al 100% per 30 secondi per rimuovere eventuali macchie in eccesso.
Immergere le sezioni ossee in un secondo tubo contenente 100%etanolo per 30 secondi e quindi trasferirle al 100% di xilene per 30 secondi. Mettere la pellicola adesiva su uno scivolo di vetro asciutto come supporto, facendo attenzione a posizionare il film il più piatto possibile. Successivamente, posizionare uno scivolo a membrana in PET sul film e premere brevemente un dito guantato sulla membrana per attaccarlo al film.
Questo campione verrà inserito tra la membrana e la pellicola adesiva. La pellicola adesiva non deve essere piegata o rugosa e non dovrebbero esserci bolle d'aria tra il film e la membrana. Iniziare utilizzando il decontaminante superficiale per pulire il supporto del tappo finale del palco.
Caricare lo scivolo nel supporto dello scivolo e i tappi nel supporto del cappuccio. Quindi, regola lo stato attivo e acquisisci una panoramica della diapositiva con l'obiettivo 1,25x. Passare all'obiettivo 40x e regolare lo stato attivo.
Usando la panoramica della diapositiva, scegliere l'area di interesse. Quindi, regolare i parametri laser come mostrato qui, assicurandosi di ottimizzare questi parametri per ogni obiettivo. Se il laser non riesce a tagliare il campione, aumentare la potenza del laser.
Selezionare osteoblasti, osteociti e cellule di rivestimento osseo in osso femore femorale distale o osso corticale in base a criteri morfologici. Tracciare una linea per il percorso laser più lontano dalle celle bersaglio per ridurre al minimo i danni causati dal laser UV. Se il laser non riesce a tagliare il campione, applicare il laser più di una volta o ispezionare il bersaglio alla ricerca di macchie di tagli incompleti e utilizzare l'opzione di spostamento e taglio per tagliare il tessuto in queste macchie.
Raccogliere ogni tipo di cella in un cappuccio separato del tubo da 0,5 millilitri. In primo luogo, erogare 50 microlitri del tampone di lisi contenente beta mercaptoetanolo nel tappo del tubo di raccolta. Lyse il campione pippetting su e giù nel tappo per un minuto.
Successivamente, spini verso il basso il lisato e aggiungi 00 microlitri del tampone di lisi contenente beta-mercaptoetanolo al tubo. Per ogni diapositiva, preparare un tubo di microcentrifugo etichettato con 350 microlitri del tampone di lisi contenente mercaptoetanolo beta. Utilizzare le sezioni rimanenti dopo l'LCM per estrarre l'RNA.
Separare accuratamente il film dalla membrana e llyse il campione pippetting lentamente il tampone dilisi sulla sezione più volte. Quindi, metti i campioni di lisato sul ghiaccio secco e conservali a meno 80 gradi Celsius. Quando è pronto per continuare, scongelare i lire a temperatura ambiente.
Successivamente, trasferire i lisati dalle celle raccolte da LCM nei tubi di raccolta ai nuovi tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri ed estrarre l'RNA secondo le istruzioni del produttore. In questo studio, viene sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee dei femore del topo. LCM viene eseguito utilizzando un sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni.
La resa e l'integrità dell'RNA isolato sono state misurate utilizzando l'elettroforesi microcapillare. La differenza nella qualità e quantità dell'RNA ottenuta utilizzando diversi protocolli di lisi può essere vista qui nel gel rappresentativo e negli elettroferogrammi. Quando il campione viene lisciviato pippetting su e giù nel tappo per un minuto, è possibile isolare circa 8,5 nanogrammi di RNA da un millimetro quadrato di tessuto osseo microdissecato.
Il valore RIN è 8.60. In alternativa, LCM viene eseguito utilizzando un sistema LCM che utilizza un impulso laser sfocato, che catapulta il materiale nel cappuccio adesivo strapiombante. Per le ossa fresche congelate, è possibile isolare circa 1,6 nanogrammi di RNA da un millimetro quadrato di tessuto osseo microsacrato.
Il valore RIN è uno. In conclusione, le cose più importanti da ricordare in questa procedura sono applicare il protocollo permanente nel modo corretto, prevenire l'essiccazione completa delle sezioni nel complesso sandwich, utilizzare un sistema LCM appropriato e non superare i limiti di tempo per la raccolta delle cellule. Una volta isolato l'RNA dalle celle acquisite, è possibile utilizzare l'RNA per la profilatura dell'espressione, ad esempio, mediante ricerca dell'RNA.
Infine, vorremmo ricordarvi che lo xilene e il beta-mercaptoetanolo sono sostanze pericolose che devono essere maneggiate sotto un cofano. Inoltre, si prega di prendere le precauzioni appropriate quando si maneggia azoto liquido e anche le lame del criotomo.
