Vorremmo ringraziare L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst e D. Kuch per l&#39;assistenza sul campo. K. Galbreath gentilmente fornito campioni di fegato pika dalla Bella Coola valle. Grazie ad A. Gonçalves da Silva e K. Larsen per interessanti discussioni che hanno contribuito alla progettazione di questo metodo non invasivo di campionamento genetico. Questo lavoro è stato finanziato dalla scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada Discovery, e UBC Okanagan borse di ricerca individuali a marzo Il Fondo nazionale svizzero di Dottorato Fellowship Foundation PBSKP3_128523 supportato PH. Questo studio è stato intrapreso a seguito del protocollo di cura degli animali presso la University of British Columbia (numero del certificato: A07-0126).

1. Capelli rullante Prima della creazione di una trappola, una posizione ideale deve essere determinato entro l&#39;habitat pika o scarpata. Questo include mucchi di fieno, che sono cache vegetazione che gli animali raccolgono a fine estate così come escrementi freschi trovati in siti latrina. Strisce di nastro di imballaggio (10-50cm di lunghezza) sono arrotolate per fornire a 360 ° appiccicoso superficie e sono disposti in una web-come il modo di busta l&#39;ingresso al mucchio di fieno del pika (Fig. 1) o sito latrina. A seconda della configurazione delle rocce, un pezzo di filo da pesca può essere utilizzato per sostenere la struttura dal laccio dei capelli, ma questo spesso non è necessario quando le entrate sono molto piccole (30cm &lt;di diametro), una descrizione completa dell&#39;uso di linea di pesca si trovano in Henry e Russello (2010) 3. Insidie ​​capelli vengono controllati più spesso possibile, e campioni di capelli depositato sul nastro (Fig. 2) vengono poi raccolti ed etichettati. Una volta trasportato al laboratorio, i peli vengono rimossi dal nastro adesivo con pinza sterile e trasferiti in tubi criogenici e conservati a -20 ° C fino a ulteriori manipolazioni. Campioni di capelli raggruppati insieme lungo un laccio dei capelli sono considerate appartenenti ad un singolo individuo, mentre i campioni raggruppati in modo indipendente si presume che appartengono a persone diverse. In quest&#39;ultimo caso, il pelo è poi messo in tubi diversi. Queste ipotesi possono poi essere sperimentato nell&#39;ambito di impronte digitali del DNA e calcoli delle probabilità di identità basata su microsatellite dati genotipici. 2. Estrazione del DNA Poiché i capelli pika è molto sottile e contiene una piccola lampadina di radice, abbiamo precedentemente dimostrato che un minimo di 25 peli sono necessari per ottenere quantità sufficienti di DNA per una buona qualità di amplificazione a valle della PCR 3. Abbiamo usato il DNA del sistema IQ (Promega, Madison, WI, USA) e una versione leggermente modificata di istruzioni del produttore per l&#39;isolamento di DNA da campioni di capelli. In primo luogo, il campione di capelli è filato giù in una micro-centrifuga al fine di evitare la perdita dei capelli durante l&#39;apertura del tubo. Allora la soluzione di incubazione è preparata mescolando 80 ml di soluzione di incubazione con 10μl di DTT (1M) e 10μl di proteinasi K (18ng/ml) per portare a una concentrazione finale di 0,1 M DTT e 1.8ng/ml di incubazione proteinasi K. soluzione (100 l) viene aggiunto al campione e incubare a 56 ° C per 1 ora. Nel frattempo, la soluzione di lisi è preparata con l&#39;aggiunta di 1 ml di DTT (1M) per ogni 100 microlitri di tampone di lisi, con una conseguente concentrazione DTT finale di 0.01M. Soluzione di lisi preparata (200 microlitri) viene poi aggiunto il campione, insieme con 7 ml di resina DNA IQ, in agitazione per 3 secondi ad alta velocità e incubate a temperatura ambiente per 5 minuti. Il campione viene quindi in agitazione per 2 secondi e inserito nel supporto magnetico, in cui la separazione delle sfere magnetiche dalla soluzione si verifica. La soluzione rimanente viene poi aspirato ed eliminato, facendo attenzione a non disturbare il pellet di resina magnetica. Il campione viene quindi trattato con 100 microlitri della soluzione di lisi preparata, agitazione orizzontale e restituito al supporto magnetico in cui la separazione si verifica nuovamente. Il buffer di lisi è aspirato ed eliminato, e questo passo è ripetuto tre volte con un tampone di lavaggio (100 l). Il campione viene poi lasciato ad asciugare nello stand magnetico per 15 minuti. Una volta asciutto, 100 ml di tampone di eluizione è aggiunto al campione e incubare a 65 ° C per 5 minuti. Il campione è in agitazione e inserito nel supporto magnetico. La soluzione che ora contiene il DNA eluito è poi trasferito in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e conservati a -20 ° C fino a ulteriori manipolazioni. DNA da campioni di fegato è stato anche estratto con il sistema IQ DNA e utilizzato come controllo positivo per amplificazioni PCR. 3. Amplificazione PCR Il DNA ottenuto dal nostro rullante capelli non invasivo e campioni di fegato sono stati poi utilizzati per amplificare una suite di uso comune marcatori molecolari (microsatelliti, AFLP, mitocondriale citocromo B e ZFX / ZFY marcatore sexing). PCR sono state eseguite utilizzando un Veriti termociclatore (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in un volume di 25 microlitri contenente: 10 - 20 ng di DNA, 0,5 mM di ciascun primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 mM dNTPs, 10 μ albumina sierica bovina (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e 0,5 U AmpliTaq DNA polimerasi Gold (Applied Biosystems). Parametri di ciclismo per i loci microsatelliti sono stati ottimizzati utilizzando un programma di ciclismo touchdown (10 min a 95 ° C, 35 cicli a 95 ° C per 30 s, 30 s ricottura, e 45 s a 72 ° C, seguita da una fase finale a 72 ° C per 10 min). La temperatura di annealing è diminuita di 1 ° C ogni ciclo di 60-55 ° C fino a raggiungere il sesto ciclo, a questo punto le 29 rimanenti cicli continuato a 55 ° C. Parametri di ciclismo per i frammenti mitocondriale sono state come sopra descritto, ma consisteva di 35 cicli con una ricotturatemperatura di 50 ° C. Amplificato polimorfismo della lunghezza dei frammenti è stata intrapresa a seguito del protocollo di genomi dei vertebrati descritto da Bonin 4. Infine, sessaggio molecolare è stata effettuata utilizzando la PCR-RFLP di ZFX / ZFY loci digestione con enzimi di restrizione HinfI 5. I prodotti PCR dal, AFLPs microsatelliti e sequenze del citocromo B sono stati eseguiti su un analizzatore genetico ABI 3130XL (Applied Biosystems), mentre digerito ZFX / ZFX frammenti sono stati eseguiti lungo una scala 100 bp (New England Biolabs) su un 3% gel contenente 2,5% gel DNA SYBR Safe. macchia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e visualizzati utilizzando un sistema di imaging ROSSO personale gel (Alpha Innotech, San Leandro, California, USA) Microsatelliti e AFLPs sono state visualizzate mediante Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) e il cromatogramma DNA mitocondriale è stata osservata con Sequencher v4.7 (Gene Codice Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Rappresentante risultati Il DNA estratto da campioni di capelli ottenuto con il nostro rullante non invasiva sono stati utilizzati per amplificare PCR vari tipi di marcatori molecolari. Come base per il confronto, usando campioni di DNA estratto di fegato è stato amplificato insieme ai nostri campioni di capelli. Nucleare loci microsatelliti sono stati amplificati con successo sia per i capelli e campioni di fegato (Fig. 3). Anche se l&#39;intensità del segnale era maggiore quando si utilizzano i campioni di fegato, questo non ha avuto un effetto negativo sul punteggio genotipo (Fig. 3). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando AFLPs (Fig. 4), sequenze di DNA mitocondriale (Fig. 5), e il ZFX / ZFY marcatore sessaggio molecolare (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Un esempio di trappola capelli non invasivo istituito presso un mucchio di fieno. Strisce di nastro adesivo trasparente arrotolato imballaggio sono disposti in un web-come la moda di allegare l&#39;ingresso del mucchio di fieno. Un pezzo di filo da pesca è qui usato per fornire sostegno supplementare per il rullante capelli. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una trappola capelli successo contenente un gran numero di capelli attaccati al nastro di imballaggio. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Un cromatogramma rappresentativo microsatelliti nucleari (Ocp6) 8 che vedi nell&#39;immagine Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, ed è eterozigote (354/358) a questo locus. Il cromatogramma basso rappresenta un individuo diverso che presentano un genotipo eterozigote (358/362) a base di DNA estratto da peli. Mentre il segnale del cromatogramma dal campione dei capelli ha una minore intensità rispetto al campione di fegato, segnando genotipo non è pregiudicata da questa differenza di segnale. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. AFLP un cromatogramma rappresentativo (E31T32) come mostrato in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, il cromatogramma basso rappresenta il DNA estratto dai capelli. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Un rappresentante cromatogramma sequenza del DNA mitocondriale (citocromo B) come mostrato in Sequencher v4.7 (Gene Codice Corporation). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, il cromatogramma basso rappresenta il DNA estratto dai capelli. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Un indicatore rappresentativo sessaggio molecolare (ZFX / ZFY), amplificata sia per fegato e campioni di capelli. Questo approccio si basa sull&#39;osservazione che il cromosoma Y possiede un sito di restrizione HinfI in questa regione del cromosoma X che manca. Quindi, le femmine producono due co-migrazione dei frammenti di 432 bp, mentre i maschi producono frammenti di 432 bp, 261 bp e 171 bp.

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	<li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population.">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li><li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size,+natal+philopatry,+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+(Aquila+heliaca)+in+central+Asia.">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li><li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger.">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li><li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares.">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li><li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+(AFLP)+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395.">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li><li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+European+rabbits+(Oryctolagus+cuniculus),+European+brown+hares+(Lepus+europaeus)+and+mountain+hares+(Lepus+timidus)+with+ZFX+and+ZFY+loci.">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li><li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species.">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li><li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demographic+monitoring+of+an+entire+species+(the+northern+hairy-nosed+wombat,+Lasiorhinus+krefftii)+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material.">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li><li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails.">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li><li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika,+Ochotona+princeps.">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il campionamento non invasivo genetica è diventata una valida alternativa ai tradizionali metodi di cattura dal vivo per diversi motivi. In primo luogo, discretamente raccolta di materiale biologico (ad esempio, le feci, peli, piume, saliva e muco) da popolazioni selvatiche, i ricercatori possono studiare senza disturbare queste specie, la gestione, o anche l&#39;osservazione, riducendo così i rischi sia per gli animali e ricercatori. In secondo luogo, il campionamento non invasivo genetica permette ai biologi di studiare le popolazioni di specie elusive e rare, un compito che può rivelarsi difficile con la più tradizionale live-trapping approcci 6. E in terzo luogo, NGS possono potenzialmente aumentare le dimensioni del campione, riducendo disturbo agli animali, gli sforzi di campionamento, e costi, contribuendo così a minimizzare i pregiudizi delle stime dei parametri della popolazione 7. Quest&#39;ultimo punto potrebbe rivelarsi cruciale quando si tratta di specie minacciate, dal momento che stime distorte dei parametri di popolazione può portare a gestione inadeguata. Nel video presente articolo viene descritto un metodo semplice, romanzo, economico e non invasivo per esempio sfuggente piccoli mammiferi, con l&#39;americano Pika come esempio. Abbiamo dimostrato che il DNA estratto dai capelli esegue in modo simile al DNA estratto da campioni di fegato rispetto ai microsatelliti, AFLP, mitocondriali e marcatori determinazione del sesso, rendendo questo metodo di campionamento non invasivo una valida alternativa per vivere campionamento cattura o letali. Nel complesso, possiamo anticipare che questo metodo possa essere utile nella fase di raccolta dati di studi di genetica delle popolazioni e comportamentali delle piccole specie rare o elusivo mammifero, riducendo al minimo l&#39;impatto sugli organismi oggetto di studio.

Capelli trappola: <ul><li> Rotoli di nastro adesivo trasparente (3M, St. Paul, MN, USA) </li><li> Pesca con la lenza (£ 10) </li><li> Criogenico tubo (2 ml) </li><li> Pinza sterile </li><li> Azoto liquido Dewar (opzionale) </li></ul> Estrazione del DNA: <ul><li> DNA IQ System (Cat. # DC6701, Promega) con il tessuto e l&#39;estrazione Kit capelli (Cat. # DC6740, Promega). </li><li> MagneSphere tecnologia magnetica stand di separazione (Cat. # Z5342; Promega) </li><li> Centrifuga Micro </li><li> Ibridazione forno o bagnomaria </li><li> Provette Eppendorf 1,5 ml </li></ul>

a noninvasive hair sampling technique to obtain high quality dna from elusive small mammals

Metodi di campionamento non invasivo genetici stanno diventando sempre più importanti per studiare le popolazioni di fauna selvatica. Una serie di studi hanno segnalato utilizzando tecniche di campionamento non invasivo per studiare la genetica di popolazione e la demografia delle popolazioni selvatiche 1. Questo approccio ha dimostrato di essere particolarmente utile quando si tratta di specie rare o elusive 2. Mentre un certo numero di questi metodi sono stati sviluppati per i capelli campione, feci e altro materiale biologico da carnivori e medie imprese i mammiferi, sono rimasti in gran parte non testate in elusivo piccoli mammiferi. In questo video, vi presentiamo un romanzo, rullante capelli poco costosi e non invasivi destinati a un mammifero sfuggente piccolo, il pika americano (Ochotona princeps). Noi descriviamo il set-up generale dal laccio dei capelli, che consiste di strisce di nastro adesivo disposti in un web-come la moda e collocati lungo viaggio percorsi in habitat pikas &#39;. Illustriamo l&#39;efficienza della trappola a raccogliere una grande quantità di capelli che possono essere raccolti e portati al laboratorio. Abbiamo quindi dimostrare l&#39;utilizzo del sistema IQ DNA (Promega) per isolare il DNA e mostrare l&#39;utilità di questo metodo comunemente utilizzato per amplificare marcatori molecolari microsatelliti nucleari compresi, amplificato polimorfismi della lunghezza dei frammenti (AFLPs), sequenze mitocondriali (800bp), così come un sexing marcatore molecolare. Nel complesso, abbiamo dimostrato l&#39;utilità di questa trappola romanzo capelli non invasivo come una tecnica di campionamento per i biologi della popolazione della fauna selvatica. Ci aspettiamo che questo approccio sarà applicabile ad una varietà di piccoli mammiferi, aprendo le aree di indagine all&#39;interno delle popolazioni naturali, riducendo al minimo l&#39;impatto per gli organismi di studio.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Vi presentiamo un approccio non invasivo di campionamento per raccogliere campioni di capelli in modo efficiente da sfuggente piccoli mammiferi, come mostrato per il pika americano. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità di questo metodo di estrazione del DNA da capelli campionati e amplificare diversi tipi di marcatori molecolari comunemente utilizzati negli studi di ecologia e conservazione della fauna selvatica.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  University of British Columbia, Okanagan Campus. Vi presentiamo un approccio non invasivo di campionamento per raccogliere campioni di capelli in modo efficiente da sfuggente piccoli mammiferi, come mostrato per il pika americano. Abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo di estrazione del DNA da capelli campionati e amplificare diversi tipi di marcatori molecolari comunemente utilizzati negli studi di ecologia e conservazione della fauna selvatica.

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

L&#39;ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

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Biologia

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Non invasiva In Vivo Piccoli Animali MRI e MRS: Basic procedure sperimentali

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

Uno strumento web per la generazione di alta qualità Machine-readable vie biologiche

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Methods Article

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi