This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la guida canadese per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato per la protezione degli animali Laval Université. Preparazione 1. Campione NOTA: In questo esempio, abbiamo usato il cervello di topo al giorno postnatale 1. <ol><li> Utilizzare l&#39;anestesia ipotermia in ghiaccio tritato da 3 a 4 min per cuccioli, poi sezionare cervello più rapidamente possibile in mezzo L15 ghiacciata. Eseguire questo passaggio all&#39;interno di 2 min. </li><li> Trasferimento sezionato cervelli in embedding muffa (cfr. Elenco di materiale) e riempire con i media tessuti congelati embedding avendo cura di orientare il campione nella posizione desiderata. Congelare i campioni immediatamente in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Eseguire questo passaggio entro 30 sec. NOTA: I campioni possono essere conservati alcuni mesi, senza compromettere la qualità dell&#39;RNA. </li></ol> 2. Sezioni <ol><li> Membrana Treat coavetrini ted vetro (cfr. elenco di materiale) con la soluzione di RNAse superficie di decontaminazione per eliminare ogni traccia di RNasi. Lavare i vetrini in acqua DEPC e lasciarli asciugare. In alternativa, i vetrini cuocere overnight a 200 ° C. </li><li> Trasferire i campioni congelati in un criostato precedentemente pulito con una soluzione di superficie RNAse decontaminazione. Impostare la temperatura della camera criostato a -20 ° C e fetta campioni a 10 micron di spessore. Raccogliere sezioni di tessuto sulle slitte membrana rivestita e lasciarli asciugare 10 minuti prima della colorazione. In alternativa, negozio scivola a -80 ° C fino a colorazione. </li></ol> 3. Preparazione di colorazione Solutions <ol><li> Preparare tutte le soluzioni appena prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, e utilizzare inibitore RNAse in tutte le soluzioni di colorazione (tranne per le soluzioni di lavaggio) per prevenire la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Preparare la soluzione tampone. Utilizzare lo stesso buffer in tutte le soluzioni (composto da PBS RNasi-free (PBS) supplementato del 1% BSA,0,2% triton e inibitore RNAse 2%). Per ciascun vetrino, preparare 400 ml di soluzione tampone (200 microlitri per il primario e 200 microlitri per gli anticorpi secondari). </li><li> Preparare la soluzione fissativa: utilizzare il 70% di etanolo mantenuto a -20 ° C. Mantenere tessuto procedura di sintesi minima per evitare una drastica riduzione della resa di estrazione dell&#39;RNA. NOTA: In alternativa, usare una soluzione di etanolo al 95% integrata del 5% di acido acetico conservato a -20 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo l&#39;anticorpo primario nella soluzione tampone. Per l&#39;etichettatura dei neuroni dopaminergici, utilizzare un anticorpo targeting tirosina idrossilasi (TH, enzima limitante per la produzione di dopamina). Utilizzare un&#39;alta concentrazione di anticorpi per compensare il tempo di incubazione rapido. Utilizzare anticorpo TH ad una diluizione 1:25. NOTA: Nel normale protocollo immunofluorescenza, questo anticorpo dà un forte segnale quando incubato overnight a una diluizione di 1: 1000. In questo protocollo, è usato 40X più concentratcato a causa del breve tempo di incubazione. Data l&#39;elevata concentrazione di anticorpo utilizzato per questo metodo, eseguire una immunocolorazione normale in parallelo per controllare qualsiasi aumento etichettatura non specifico. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo l&#39;anticorpo secondario nella soluzione tampone. Utilizzare un anticorpo secondario biotinilato ad una concentrazione di 1: 100. NOTA: In questo esempio, abbiamo utilizzato un anticorpo biotinilato anti-coniglio. </li><li> Preparare la soluzione avidina-biotina complesso (ABC) per la rilevazione di anticorpi secondari biotinilati. Preparare la soluzione ABC aggiungendo il composto A e il composto B ad una concentrazione di 1: 100 diluito in PBS DEPC completato con inibitore RNAse 2%. Preparare l&#39;avidina-biotina complesso 30 minuti prima di aggiungerlo alle diapositive. </li></ol> 4. Colorazione <ol><li> Scongelare uno o due scivoli al momento da -80 ° C da loro sfogliando in aria velocemente (o utilizzare un getto d&#39;aria). Sezioni Surround con idrofobicapenna barriera e lasciare asciugare per alcuni secondi. <ol><li> Mettere i vetrini nella soluzione di fissativo freddo per non più di 5 minuti a -20 ° C. Agitare volta in aria per rimuovere l&#39;eccesso di soluzione di fissativo poi, rapidamente immergere i vetrini in tempi DEPC PBS 6-8 per il lavaggio. </li><li> Flick le diapositive per rimuovere l&#39;eccesso di DEPC PBS. Assicurarsi che le diapositive sbrinamento passo non superi i 5 min. </li></ol></li><li> Collocare i vetrini su un vassoio pulito (pretrattato con una soluzione di superficie RNAse decontaminazione per eliminare ogni traccia di RNasi) e mettere 200 microlitri della soluzione di anticorpo primario su ciascuna slitta (coniglio anti-TH) per 10 min a temperatura ambiente. Dip scorre rapidamente in DEPC PBS 3 volte per il lavaggio e aspirare i vetrini volta per rimuovere l&#39;eccesso di DEPC PBS. </li><li> Mettere 200 microlitri della soluzione di anticorpo secondario su ciascun vetrino per 6 minuti a temperatura ambiente. Dip scorre rapidamente 3 volte in PBS DEPC per il lavaggio e aspirare i vetrini per rimuovere l&#39;eccesso di DEPC PBS. </li><li> Mettere 200 ml di Solu ABCzione su ciascun vetrino per 4 minuti a temperatura ambiente. Dip scivola rapidamente in DEPC PBS 3 volte per il lavaggio e flick le diapositive per rimuovere l&#39;eccesso DEPC PBS. </li><li> Preparare il DAB (3,3 &#39;diaminobenzidina) soluzione durante la 4 min di incubazione nella soluzione ABC. Utilizzare i reagenti forniti nel kit (Kit DAB perossidasi substrato). Miscelare 1 goccia di tampone fornito, 1 goccia di soluzione DAB e 1 goccia di 30% H 2 O 2 in 2,5 ml di acqua DEPC. Miscelare la soluzione capovolgendo. </li><li> Prendere 196 microlitri della soluzione DAB e aggiungere 4 microlitri (2%) di soluzione inibitore RNAse appena prima stesura su vetrini. Collocare i vetrini su un vassoio pulito (pretrattati con una soluzione di decontaminazione RNAse superficie) e mettere i 200 ml di soluzione di DAB su vetrini. NOTA: la soluzione DAB dovrebbe reagire within1 o 2 min. </li><li> Dip scivola rapidamente in DEPC PBS 3 volte per il lavaggio e mettere i vetrini per alcuni secondi in etanolo assoluto. Asciugare i vetrini da essi sfogliando in aria (o utilizzare un getto d&#39;aria). &lt;br /&gt; NOTA: Le diapositive possono essere conservati a -80 ° C per un uso futuro o trattati per LCM. </li></ol> 5. Laser Capture Microdissection <ol><li> Scongelare scivoli rapidamente da loro sfogliando in aria (o utilizzare un getto d&#39;aria). Assicurarsi che le diapositive sbrinamento passo non superi i 5 min. </li><li> Procedere alla LCM. Posizionare il vetrino sotto il microscopio con il lato del campione di fronte al tappo del tubo di raccolta. Scegliere il migliore di ingrandimento per il campione. Regolare il fuoco per vedere le cellule di interesse. <ol><li> Definire la zona di taglio e iniziare il taglio con il laser. Raccogliere le cellule sezionato o pezzo di tessuto nel tappo della provetta di raccolta riempito con 50 ml di tampone di lisi (dal kit di estrazione RNA). Assicurarsi che la fase di LCM non superi il 30 min. </li></ol></li><li> Estratto RNA totale da cellule isolate utilizzando un kit di estrazione di RNA (cfr. Elenco dei materiali). Seguire il protocollo del produttore. <ol><li> Incubare le cellule raccolte per 30 minuti a 42 ° C perlisare le cellule. Pre-condizione RNA depurazione colonna aggiungendo 250 ml di tampone di condizionamento. Carico 50 ml di etanolo a cellule lisate. Caricare i 100 ml di cellule lisate su una colonna di purificazione Precondizionato. </li><li> Centrifugare la colonna a 16.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare la colonna due volte con tamponi di lavaggio. Eluire nel volume consigliato minimo (11 ml) di acqua RNase-free (non DEPC trattati come potrebbe interferire con il bioanalyser). Tenere 2 ml per verificare qualità. NOTA: Tutte le soluzioni ei reagenti sono forniti nel kit. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthesis e quantitativa RT-PCR <ol><li> Reverse-trascrivere campioni di RNA da laser catturato cellule dopaminergiche nel DNA complementare utilizzando trascrittasi inversa e oligo (dT). Seguire il protocollo del produttore (cfr. Elenco del materiale). </li><li> Usare 1 ml di cDNA per qRT-amplificazione PCR con primer specifici geni. Impostare rea PCRZIONI nel volume 20 microlitri di una miscela di reazione avviamento a caldo monocomponente per PCR quantitativa, come consigliato dal produttore. Effettuare ogni reazione in triplice copia. <ol><li> Per gli esperimenti descritti, utilizzare le seguenti coppie di primer: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li> Eseguire quantitativa di amplificazione RT-PCR utilizzando i seguenti parametri cicli rapidi: 95 ° C per 5 min seguita da 45 cicli di 10 secondi a 95 ° C, 10 sec a 60 ° C e 10 sec a 72 ° C. Effettuare analisi della curva di fusione con l&#39;impostazione predefinita dello strumento di determiformazione prodotto omogeneo ne. </li><li> Analizzare i dati utilizzando il software built-in. <ol><li> Normalizzare i valori di espressione dei geni marcatori DA Th e AADC con l&#39;espressione dei due geni di riferimento GAPDH e Rpl13a di ottenere livelli di espressione relativi come descritto in precedenza 14. </li></ol></li></ol>

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T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il punto più critico di questo metodo consiste nel etichettatura cellule di interesse impedendo la degradazione dell&#39;RNA. Come RNasi sono attivi in soluzione acquosa, diminuendo i tempi di incubazione migliora conservazione RNA 11,15. Tutte le soluzioni utilizzate devono essere trattati con DEPC per inattivare RNasi. Tutti i materiali e le superfici devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione RNAse superficie per evitare la contaminazione RNasi. Infine, in queste condizioni, l&#39;aggiun...

Il cervello è composto da una grande varietà di diversi tipi di neuroni che formano reti complesse. Questi neuroni sono organizzati in gruppi distinti e sottogruppi in base alla loro morfologia, la connettività e l&#39;espressione genica modello 1. Lo sviluppo di microarrays, sequenziamento di prossima generazione, e qRT-PCR offerta la possibilità di confrontare i profili di espressione genica di popolazioni neuronali in differenti contesti biologici 1,2. Queste analisi sensibili richiedono l&#39;identificazione precisa e l&#39;isolamento di tipi cellulari di interesse, mantenendo l&#39;integrità RNA 2-4. Fluorescente cell sorting (FACS) tecnica attivato è stato ampiamente utilizzato per isolare specifici tipi cellulari basati su marcatori di superficie cellulare e / o morfologia. FACS richiede una fase di dissociazione cellulare prima di smistamento, che si traduce in una perdita completa della risoluzione spaziale 5. Molti sottopopolazioni neuronali si distinguono gli uni dagli altri in base alla loro distribuzione anatomica in the cervello. Microdissezione laser applicata su sezioni di cervello sottili fornisce un&#39;opzione adeguata per specifico isolamento di cellule con alta risoluzione spaziale 6-8. Una limitazione importante di LCM è stata la necessità di individuare le cellule di interesse sulla base di criteri morfologici o reporter di proteine ​​fluorescenti geneticamente in modelli animali. Lo sviluppo di nuove tecniche per eseguire metodi immunomarcatura veloci che conservano l&#39;integrità dell&#39;RNA, in combinazione con LCM, consente ora l&#39;isolamento delle sottopopolazioni di cellule di procedere con esperimenti-genica. Questo approccio è stato già eseguito e brevemente descritti in poche pubblicazioni 1,9-13. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata per ottenere RNA di alta qualità da uno specifico sottogruppo di cellule in una struttura del tessuto complessa combinando immunomarcatura rapido con LCM. Mostriamo come eseguire principali passaggi critici per ottenere il recupero RNA massima e di evitare la degradazione dell&#39;RNA come può sigsignificativamente gene impatto profilo di espressione. Per la dimostrazione di questo protocollo, i neuroni dopaminergici da un giorno-vecchio mouse mesencefalo stati presi di mira. Neuroni dopaminergici possono essere immunolabeled utilizzando un anticorpo diretto contro la tirosina idrossilasi (TH), l&#39;enzima limitante per la sintesi della dopamina. Dopo immunostaining TH, individuali o gruppi di neuroni dopaminergici possono quindi essere isolato con LCM. Microdissezione cellule sono raccolte in tampone di lisi, e RNA viene estratto utilizzando un kit di isolamento di RNA. Qualità e quantità di RNA estratto sono misurati utilizzando un Bioanalyzer 5. Ulteriori analisi dell&#39;espressione genica utilizzando: RNA sequencing, microarray, o qRT-PCR può essere successivamente eseguita 2,4,6. Come esempio, in due fasi qRT-PCR è dimostrata sulle laser catturato domini isolati dopaminergici. Quantificazione relativa dei livelli di espressione di due geni marcatori dopaminergici neuron illustra la selettività di questo protocollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Microdissezione laser (LCM) permette l&#39;isolamento di cellule specifiche da sezioni di tessuto sottili con alta risoluzione spaziale. LCM efficace richiede una precisa identificazione di cellule sottopopolazioni da un tessuto eterogeneo. Identificazione di cellule di interesse per LCM è di solito basato su criteri morfologici o reporter proteina fluorescente. La combinazione di LCM e rapido immunomarcatura offre un mezzo alternativo ed efficace di visualizzare specifici tipi cellulari e di isolarli dal tessuto circostante. RNA di alta qualità può essere estratto da una popolazione di cellule puro e ulteriormente trattati per applicazioni a valle, tra cui RNA-sequencing, microarray o qRT-PCR. Questo approccio è stato già eseguito e brevemente descritto in alcune pubblicazioni. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di illustrare come eseguire una rapida immunomarcatura di una popolazione di cellule, mantenendo l&#39;integrità dell&#39;RNA, e come isolare queste cellule specifici utilizzando LCM. Qui, illustriamod questa procedura multi-passo immunomarcatura e catturando cellule dopaminergiche nel tessuto cerebrale da un giorno d&#39;età topi. Evidenziamo chiave passaggi critici che meritano particolare attenzione. Questo protocollo può essere adattato ad una varietà di tessuti e cellule di interesse. I ricercatori di diversi settori probabilmente beneficiare della dimostrazione di questo approccio.

Questa procedura permette immunomarcatura rapida visualizzazione di cellule di interesse, mantenendo l&#39;integrità dell&#39;RNA. La Figura 1 illustra le fasi di preparazione del tessuto prima dell&#39;estrazione dell&#39;RNA. Dopo criosezionamento, neuroni dopaminergici vengono etichettati utilizzando un anticorpo diretto contro la tirosina idrossilasi (neuroni marcati appaiono in marrone). A seconda della domanda sperimentale, singole cellule o grande regione di interesse possono essere isolati con ...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Analisi dell&#39;espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.

RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  Université Laval.  Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser. 

Video: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Ricerca

Biologia

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Estrazione RNA da cellule Neuroprecursor Utilizzando il Bio-Rad RNA totale Kit

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

L&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; Drosophila</em&gt; Follicolo isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...