L'obiettivo generale di questa procedura è quello di delineare le fasi chirurgiche coinvolte nell'impianto di array di microelettrodi per la registrazione elettrofisiologia cronica in marmoset che si comportano liberamente. Le marmotte sono piccoli primati che vengono sempre più utilizzati nella ricerca sulle neuroscienze. Questi animali condividono molti dei vantaggi pratici e logistici dei roditori.
La loro propensione al gemellaggio e l'elevata fecondità in giovane età significano un facile accesso a coorti grandi e geneticamente simili. Inoltre, le loro piccole dimensioni del corpo li rendono facili e relativamente economici da curare. Come primati, la marmotta ha un sistema nervoso centrale che è molto più simile a un essere umano che a quello di un roditore.
Ciò include una corteccia prefrontale e un sistema visivo altamente sviluppati. Un vantaggio che le marmotte hanno rispetto a molte altre specie di primati, tuttavia, sono i progressi compiuti nel modificarli geneticamente. Con un genoma profondamente sequenziato e un successo che genera animali knock-in e knock-out fondatori, è chiaro che la marmotta è pronta a diventare un potente modello per studiare la funzione cerebrale in salute e malattie.
Un metodo comune per lo studio della funzione cerebrale prevede l'impianto di elettrodi in luoghi anatomicamente specifici. Ciò consente di registrare cronicamente l'attività neurale in diverse aree bersaglio in animali svegli e che si comportano liberamente. Prima dell'intervento chirurgico determinare la coordinata zero intraorale per tutti gli impianti e le guide.
Per fare ciò, attaccare ogni array di elettrodi che verrà impiantato a un portaodi e impostare un micro filo allo zero intraorale. Qui è dove si incontrano gli auricolari. Ripetere questa condizione per gli array e i supporti aggiuntivi degli elettrodi, se necessario.
Inoltre, ripetere questo con un ago calibro 24 collegato in modo simile a un supporto per sonde stereotassiche. Per gli array elettrofisiologici, un filo di terra deve essere saldato a ogni altra vite che verrà utilizzata. Infine, organizzare e sterilizzare tutti gli strumenti, le attrezzature e gli usa e getta in preparazione alla procedura chirurgica.
Il giorno dell'intervento assicura che l'animale non abbia mangiato per sei ore prima di iniziare l'anestesia. L'atropina e la ketamina saranno utilizzate per indurre l'anestesia mediante iniezioni sequenziali e intramuscolari. Quindi, radere la testa agli animali usando i tosaerba da barbiere.
È importante intubare l'animale durante l'intervento chirurgico. Il nostro metodo preferito consiste nel attaccare una fascia elastica al tavolo chirurgico che inseriamo dietro i canini degli animali mentre è in posizione supina. Successivamente usiamo una sonda con punta di cotone per tamponare asciugare la lingua della marmotta e afferrarla in una mano.
Ciò consente a un tecnico di aprire la bocca e le vie aeree con una sola mano. Dopo aver inserito il tubo endotracheale, attaccarlo all'assemblaggio dell'anestesia con il ventilatore artificiale impostato su 40 respiri al minuto. Fissare il tubo e l'assemblaggio con nastro adesivo, se necessario.
Con la marmotta ora in posizione prona fissare la testa dell'animale nel telaio stereotassico. Per fare ciò, in primo luogo, inserire la punta dell'auricolare destro nel canale uditivo destro dell'animale. Seguito dalla barra dell'orecchio sinistra nel canale uditivo sinistro.
Successivamente, la testa deve essere livellata in modo che il piano orizzontale sia parallelo al telaio, mentre il piano anteriore/posteriore è centrato. Ciò si ottiene centrando prima la testa dell'animale utilizzando le misure della barra dell'orecchio fissate a distanze uguali. In seguito, il pezzo della bocca viene inserito nella bocca dell'animale e regolato fino a toccare la tavolozza dell'animale, mentre le barre orbitali stanno solo toccando il margine inferiore dell'osso orbitale.
Poiché il piano orizzontale è definito come il piano che passa attraverso il margine inferiore dell'osso orbitale e il centro del medius uditivo esterno, si dovrebbe assicurarsi che la superficie inferiore dell'osso orbitale sia ora allineata orizzontalmente con il centro delle barre dell'orecchio prima di procedere. Durante la procedura, è importante mantenere tutti i segni vitali. Quindi si dovrebbe collegare un pulsossimetro portatile alla mano del marmoset per garantire che la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno siano entro gli intervalli accettabili.
Inoltre, una sonda di temperatura rettale collegata a un riscaldante omeotermico impostata per 37 gradi centigradi e attaccata alla coda, garantirà che la temperatura corporea della marmotta non sia influenzata negativamente dall'anestesia. L'ultimo passo preoperatorio è pulire e disinfettare la testa rasata dell'animale con clorexidina e iodio, prima di coprire l'animale con un campo chirurgico sterilizzato. Eseguire un'incisione nella linea mediana del cuoio capelluto dopo aver applicato un analgesico locale in questo sito.
Per preparare la superficie del cranio, in primo luogo, staccare con cura il muscolo temporale dal cranio. Questo viene fatto tagliando la fossa al suo inserimento nel cranio con un bisturi. Dopodiverso, il muscolo temporale deve essere delicatamente separato dal cranio, usando un raspaatorio periosteale.
Proseguendo con il raspaatorio periosteale rimuovere il periostio da tutto il cranio esposto raschiando. Successivamente, contrassegnare la posizione della craniotomia creando fori di bava poco profondi nella superficie ossea e forando il perimetro della craniotomia. Praticare da sei a otto fori a vite, se necessario, nel cranio e impiantare le viti.
In questo momento, avvolgere i fili di terra saldati a una determinata vite intorno alla vite non saldata adiacente. Rimuovere l'osso al centro della craniotomia usando le forcep McPherson. Mentre il cervello e dura mater vengono scoperti, tenerli idratati con soluzione salina sterile.
Per rimuovere il dura mater, un ago calibro 25 o 26 deve essere piegato a circa 90 gradi per facilitare la foratura e il sollevamento della superficie del dura mater lontano dalla superficie del cervello. A questo punto, le micro forbici vengono utilizzate per asportare la dura mater. Attaccare gli elettrodi al micromanipolatore stereotassico e posizionarlo, in modo che l'elettrodo si trova alle coordinate anteriore/posteriore e mediale/laterale desiderate.
Ora, abbassa la punta dell'elettrodo fino a tocca la superficie del cervello. Inserire lentamente l'array nel cervello, fino a raggiungere le coordinate dorsali/ventrali desiderate. Aggiungere una goccia di vernice argentata tra il filo di terra e ogni vite per garantire un collegamento elettrico.
Fissare l'elettrodo al cranio applicando l'acrilico dentale al cranio esposto, una vite e l'array di elettrodi. Ripetere questa procedura di impianto con eventuali array aggiuntivi. Infine, utilizzando l'acrilico dentale, fare un robusto cappuccio della testa intorno all'estensione laterale degli array e completamente nel caso in cui i fili di terra e qualsiasi cranio o vite esposti.
Se necessario, è possibile inserire una barra di supporto nel cappuccio della testa e sigillarla in posizione con acrilico dentale. Dopo la creazione del cappuccio della testa sutura la pelle se il muscolo o il tessuto osseo è esposto. Una soluzione antisettica dovrebbe essere applicata anche alla ferita in questo momento.
Con l'intervento chirurgico completato è tempo di iniziare il recupero. In primo luogo, spegnere l'alimentazione di isoflurane, ma non l'ossigeno, e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico. Posizionare l'animale sulla pagina di riscaldamento, con l'ossigeno mantenuto attraverso il tubo endotracheale.
Quando inizia il primo segno di riflessi neurogenici come gli spasmi laringei, rimuovere il tubo endotracheale. L'ossigeno dovrebbe ora essere fornito con una maschera fino a quando l'animale non presenta chiari segni di recupero anestetico, come riflessi protettivi, tono posturale e tentativi di ambulare. La marmotta dovrebbe essere alloggiata individualmente e lasciata per riprendersi in una gabbia pulita e in una stanza per 24-48 ore, prima di tornare alla sua gabbia di casa.
Gli animali impiantati dovrebbero essere alloggiati in gabbie separate. È importante osservare l'animale per almeno un'ora dopo l'intervento chirurgico per osservare i segni di angoscia e, in particolare, i movimenti non coordinati. Antibiotici e analgesici e farmaci antinfiammatori devono essere somministrati nei giorni successivi all'intervento chirurgico per controllare il dolore e prevenire l'infezione.
Negli interventi chirurgici riusciti, l'animale deve essere completamente recuperato entro tre o cinque giorni. Si consiglia che le sessioni di registrazione elettrofisiologia inizino almeno una settimana dopo l'intervento chirurgico. All'inizio di ogni sessione di registrazione anestetizza leggermente l'animale usando l'isoflurane e collega il connettore degli array di elettrodi a un sistema di registrazione neurale.
Posizionare l'animale all'interno della camera sperimentale e attendere il pieno recupero anestetico prima di iniziare le registrazioni. Dopo un intervento chirurgico riuscito, è possibile registrare picchi e potenziali di campo locali dagli elettrodi impiantati per diverse settimane. In definitiva, una conferma finale che gli array di elettrodi sono stati impiantati con successo nelle strutture bersaglio dovrebbe essere preformata dopo la mortem.
Le sezioni macchiate nissl contenenti tracce elettro possono essere utilizzate per determinare la posizione di ogni micro filo impiantato. Le registrazioni elettrofisiologiche croniche negli animali che si comportano svegli sono potenti tecniche utilizzate in molte linee della ricerca sulle neuroscienze. Poiché la marmotta comune offre molti vantaggi rispetto ai modelli storicamente popolari, lo scopo di questo video, è quello di aiutare altri neuroscienziati ad adottare la marmotta comune per la loro ricerca.
Oltre all'impianto di elettrodi di registrazione cronici, come descritto in dettaglio in questo video, lo stesso protocollo di chirurgia stereotassica può essere adattato per molte altre estremità sperimentali, tra cui l'impianto di elettrodi stimolanti, cannule guida e microiniezioni. Quando si adatta questo protocollo per una delle tecniche di cui sopra, il chirurgo modificherà principalmente la procedura di perforazione per conformarsi alle dimensioni dell'impianto desiderato. Inoltre, la procedura di base non è necessaria per molte di queste tecniche e può quindi essere omessa.
Indipendentemente dall'obiettivo sperimentale, dopo aver visto questo video dovresti avere una comprensione su come eseguire con successo la neurochirurgia stereotassica nella marmoset comune.
