Abbiamo ottimizzato un metodo altamente qualificato e clinicamente applicabile per l'espansione delle cellule T killer indotte da citochine derivate da PBMC e per la valutazione della loro citotossicità contro i tumori. Il vantaggio di questa tecnica è quello di fornire una procedura operativa standard per tecnici e medici per quantificare la potenza delle cellule killer indotte da citochine sia nella ricerca scientifica che nella valutazione clinica. Iniziare questa procedura con una preparazione di cellule CIK come descritto nel protocollo di testo, quindi lavare le cellule CIK con 10 millilitri di PBS sterile.
Centrifugare per 10 minuti a 300 volte G e da 18 a 20 gradi Celsius. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule con cinque millilitri di PBS. Contare i numeri di cella e testare la vitalità della cella utilizzando il test di esclusione blu del trypan.
Aliquote le cellule CIK in sei tubi steril da 1,5 millilitri ad una densità di circa 5-1 milioni di cellule per millilitro di PBS. Etichettare e trattare le celle come dettagliate nel protocollo di testo. Mescolare delicatamente le cellule CIK con gli anticorpi tubazionando delicatamente su e giù almeno tre volte con una pipetta steril da un millilitro.
Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifuga i tubi per 10 minuti a 300 volte G e da 18 a 20 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con un millilitro di PBS, quindi pipettare delicatamente le cellule su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da un millilitro.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo inferiore rotondo sterile in polistirolo a cinque millilitri con un tappo del filtro cellulare tubazionando delicatamente attraverso il cappuccio, quindi posizionare i tubi sul carosello in ordine. Aprire il software di analisi della citometria di flusso e creare una cartella sperimentale, quindi fare clic sul nuovo pulsante del campione per aggiungere un campione e un tubo all'esperimento. Assegnare ai tubi il nome elencato nel protocollo di testo.
Per creare un sistema di gating a dispersione per le popolazioni di celle CIK, selezionare prima il tubo uno e fare clic sul pulsante del grafico a punti per creare un plottaggio FSCA SSCA. Disegnare un cancello rettangolare sull'intera popolazione cellulare con una soglia FSCA maggiore di 5000 per escludere i detriti cellulari. Selezionate il parametro FSCA FSCH per il nuovo plottaggio punti e disegnate un cancello poligonale attorno a tutte le singole celle.
Selezionare il conteggio rispetto al CD3 coniugato FITC e il parametro CD56 coniugato da APC per il nuovo grafico istogramma. Selezionate il parametro CD3 coniugato FITC rispetto al CD56 coniugato da APC per il nuovo plottaggio di punti e disegnate un cancello a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni. Registrare i dati da 20.000 singole celle in ogni campione.
Fare clic sul pulsante di esempio di caricamento per analizzare prima l'esempio di controllo vuoto. Identificare l'intera popolazione di celle CIK utilizzando i parametri del canale CD56 e CD3. Aprire i file contenenti i valori statistici del singolo campione per analizzare le popolazioni di celle CIK e ristamparle in file di analisi.
Per eseguire il saggio citotossico, la cocultura CIK e le cellule leucemia mieloide cronica umana K562 aggiungendo un millilitro di cellule K562 ad ogni pozzo in una piastra a sei pozzetti ad una densità di 5 milioni di cellule per millilitro, quindi aggiungere un millilitro di mezzo basale con o senza cellule CIK alla piastra a sei pozzi come elencato nel protocollo di testo. Mescolare le sospensioni cellulari tubazionando delicatamente su e giù almeno tre volte. Posizionare la piastra nell'incubatore per 24 ore.
Ora, coculare cellule CIK e OC-3 ovarico aggiungendo un millilitro di mezzo basale con o senza cellule CIK alla piastra a sei pozzi come elencato nel protocollo di testo. Mescolare le sospensioni cellulari tubazionando delicatamente su e giù almeno tre volte. Metti la piastra nell'incubatrice per 24 ore.
Dopo l'incubazione, raccogliere la sospensione cellulare CIK K562 direttamente in un tubo sterile da 15 millilitri. Per raccogliere sia le cellule di sospensione che di aderenza dai gruppi CIK OC-3, trasferire prima la sospensione cellulare in un tubo sterile da 15 millilitri. Lavare il pozzo con un millilitro di PBS steril, raccogliere il PBS e aggiungerlo al tubo, quindi aggiungere 5 millilitri di soluzione enzimatica di dissociazione cellulare e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Aggiungere un millilitro della soluzione dallo stesso tubo al pozzo corrispondente e mescolare delicatamente le cellule tubazioni su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da un millilitro. Raccogliere tutte le celle nello stesso tubo. Centrifuga a 300 volte G per 10 minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di PBS sterile. Pellettare le cellule a 300 volte G per 10 minuti, quindi aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di PBS sterile. Aggiungere cinque microlitri di colorante 7-AAD alla sospensione cellulare.
Mescolare delicatamente le cellule con pipettando su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da un millilitro. Incubare per 10 minuti e lasciare al buio prima dell'analisi. Per eseguire il test di capacità citolitica, mescolare la sospensione cellulare e ripetere la preparazione per la citometria del flusso.
Fate clic sul nuovo pulsante campione per aggiungere un campione e un tubo all'esperimento. Assegnare ai tubi il nome elencato nel protocollo di testo. Per creare un sistema di gating a dispersione per il saggio citolitico, selezionare prima il tubo uno e fare clic sul pulsante del grafico a punti per creare un plottaggio FSCA SSCA.
Disegnare un cancello rettangolare su tutti gli eventi con una soglia FSCA maggiore di 50.000 per escludere i detriti cellulari. Selezionate il parametro SSCA CFSE per il nuovo plottaggio punti, quindi selezionate il parametro CFSE 7-AAD per il nuovo plottaggio punti e disegnate un gate a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni. Fare clic sul pulsante di esempio di caricamento per analizzare prima l'esempio di controllo vuoto.
Regolare la tensione di SSCA e FSCA. Identificare la popolazione di cellule morte utilizzando i parametri del canale CFSE e 7-AAD. Registrare i dati da più di 20.000 cellule positive CFSE in ogni campione.
Aprire i file contenenti i valori statistici di ogni singolo campione per analizzare le popolazioni di celle non disponibili ed esportare i dati in file di analisi. I risultati rappresentativi della strategia di gating per l'analisi della sottopopolazione delle cellule T positive CD-3 CD56 da donatori sani sono mostrati con l'analisi statistica della proporzione CIK da tre individui. La proporzione positiva di cellule CD56 positive cd-3 è aumentata significativamente dopo 14 giorni di espansione.
Ciò è evidente attraverso il 65% per il PBMC originale che è aumentato al 27,4% per le cellule CIK raccolte il giorno 14. In questo sistema di coltura, le cellule CIK hanno prodotto circa mezzo centinaio di cambiamenti di piega rispetto al numero originale di PBPC. Le cellule K562 sono state macchiate con un CFSE colorante non fluorescente, che viene scissi da esterases intracellulari all'interno di cellule vitali e diventa un colorante altamente fluorescente.
Vengono illustrate le dimensioni e la granularità delle cellule cik e cfse-positive. Le cellule K562 macchiate di CFSE sono state co-trattate con cellule CIK con un rapporto di zero a uno, cinque a uno e 10 a uno. Queste celle sono state macchiate con colorante 7-AAD come sonda di vitalità per l'esclusione delle cellule morte.
Le cellule positive 7-AAD delle cellule CFSE positive K562 sono state tutte valutate. Le celle OC-3 macchiate di CFSE sono state co-trattate con cellule CIK con un rapporto di 10 a uno. L'evidente citotossicità del CIK contro le cellule OC-3 è dimostrata qui dopo 24 ore di incubazione.
È stato riferito che le cellule T CIK esercitano effetti citotossici significativi contro le cellule tumorali e riducono gli effetti avversi della chirurgia, delle radiazioni e della chemioterapia nei trattamenti contro il cancro. L'immunoterapia è un trattamento promettente per un certo numero di tumori. Il CIK può essere espanso in modo efficiente in vitro mediante incubazione di PC derivati dal paziente in condizioni di grado GMP per un'ulteriore infusione autologa.
Seguendo questo protocollo, potremmo eseguire la terapia cellulare immunitaria in una struttura di grado GTP o GMP per ulteriori trattamenti clinici contro il cancro.
