Questo protocollo può essere utilizzato per correlare i modelli di attività del calcio con l'espressione genica a livello di singola cellula consentendo ai ricercatori di indagare nuove domande sulle relazioni tra queste due caratteristiche. A differenza degli approcci precedenti, che tipicamente studiano interi tessuti, la nostra tecnica ingrandisce il livello di una singola cellula permettendoci di valutare le relazioni autonome cellulari tra l'attività del calcio e l'espressione genica. Inizia sterilizzando ai raggi UV due piastre petri di plastica da 35 millimetri e una coltura cellulare di 35 millimetri per circa 30 minuti.
Lavorando nella cappa a flusso laminare, aggiungere 10 millilitri di due millimolare di soluzione di calcio a ciascuno dei due tubi conici in plastica da 50 millilitri, una piastra di Petri sterilizzata ai raggi UV e la piastra di coltura cellulare sterilizzata uv. Aggiungere due millilitri di soluzione priva di calcio e magnesio all'altra piastra di Petri sterilizzata dai raggi UV e riempire due piastre petri di plastica da 100 millimetri e una piastra di Petri in plastica da 35 millimetri con MMR 0,1X integrata con gentamicina. Quindi riempire una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri con il 70% di etanolo.
Immediatamente prima della dissezione, mescolare accuratamente 0,01 grammi di B collagene in un unico tubo di soluzione di calcio. Aggiungere la soluzione a una nuova piastra di Petri in plastica da 60 millimetri e utilizzare un microscopio sezionato per identificare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per spostare almeno sei embrioni appropriati in una piastra da 100 millimetri contenente MMR più gentamicina.
Quindi spostare un embrione dalla piastra di tenuta nella seconda piastra da 100 millimetri di MMR più gentamicina e posizionare questa piastra di dissezione al microscopio. Utilizzando un paio di forcep smussate per stabilizzare l'embrione, rimuovere con cura la membrana vitellina che circonda l'embrione con un paio di forcep fini. Quando tutta la membrana è stata rimossa, utilizzare le forcep fini per pizzicare l'embrione lungo l'asse posteriore anteriore per separare le regioni dorsali e ventrali.
Utilizzare la nuova pipetta di trasferimento sterile per trasferire la porzione dorsale nella piastra di 60 millimetri di soluzione collagenosa per uno o due minuti prima di trasferire attentamente il campione nella piastra di dissezione. Per completare la dissezione, rimuovere con cura tutta la contaminazione endodermica e mesodermica residua dal tessuto neurale presuntivo dell'ectoderma e trasferire delicatamente l'espianto nella piastra di 35 millimetri di soluzione di calcio. Una volta raccolte altre tre espianto, utilizzare una micropipetta P1000 per trasferire tutte e quattro le espianto nella piastra di 35 millimetri di soluzione priva di calcio e magnesio, facendo attenzione ad evitare qualsiasi contatto tra gli espianto e l'interfaccia dell'acqua dell'aria.
Quindi ruotare delicatamente il piatto in modo che tutte le espianto si raggruppano al centro del piatto e incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente per consentire ai tessuti di dissociarsi. Durante questa incubazione, trasferire gli ultimi due embrioni al secondo piatto di MMR con gentamicina e coprire il piatto per consentire a questi esemplari di svilupparsi indisturbati. Alla fine dell'incubazione, utilizzare la super colla per attaccare una coverslip micro-rigata sul fondo del piatto di coltura cellulare da 35 millimetri e utilizzare una micropipetta P100 per raccogliere le espianto dissociate.
Tenendo la pipetta ad un angolo poco profondo vicino alla superficie del piatto di coltura cellulare, posizionare la punta della pipetta nell'angolo della griglia rivolta verso l'interno ed espellere saldamente la sospensione cellulare attraverso l'area a griglia. Idealmente, le cellule si depositeranno in un ammasso stretto e denso. Lasciare che le cellule aderiscano alla piastra per un'ora a temperatura ambiente.
Mentre le cellule si stanno depositando, determinano e registrano lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratelli. Al termine dell'incubazione, spostare il piatto campione in una posizione protetta dalla luce e aspirare 100 microlitri di soluzione dal bordo del piatto. Mescolare questa soluzione con sette microlitri di una soluzione acida Fluo-4 AM Pluronic F127 preparata al momento con pipettazione su e giù prima di restituire l'intero volume al piatto campione.
Ruotare delicatamente per mescolare e coprire la piastra con un foglio di alluminio. Dopo un'ora a temperatura ambiente, sostituire un millilitro del supernatante piatto di coltura explant con tre millilitri di soluzione di calcio fresca due millimolare. Quindi sostituire tre millilitri di supernatante con tre millilitri di soluzione di calcio fresco altre due volte.
Per l'imaging dell'attività del calcio all'interno delle espianto, posizionare la piastra campione sullo stadio di un microscopio confocale invertito protetto dall'esposizione alla luce ambientale e utilizzare un marcatore per etichettare il punto anteriore della piastra in modo che lo stesso campo visivo possa essere trovato nelle sessioni di imaging successive. Utilizzare gli obiettivi 10 e 20 volte per localizzare un campione al microscopio e selezionare un campo visivo appropriato che sia denso di cellule ma non così denso che le cellule siano raggruppate o difficili da distinguere individualmente. Regolare lo stato attivo del microscopio in modo che il coverslip regolato dalla griglia sia visibile, modificando il campo visivo originale fino a quando un numero identificabile non è nel fotogramma in base alle esigenze.
Ottenere un'immagine di campo luminoso del campo visivo selezionato con il coverslip regolato dalla griglia a fuoco e un'immagine di campo luminoso del campo visivo selezionato con le celle a fuoco. Senza un'immagine chiara del coverslip a griglia e del campo visivo, non sarai in grado di registrare le tue celle con quelle nelle immagini dei pesci che genererai in seguito. Quindi illuminare i campioni con un laser da 488 nanometri.
Per un'immagine di due ore, modificare la configurazione dell'imaging per registrare 901 fotogrammi con un tempo di scansione di 3,93 secondi in un intervallo di otto secondi prima di eseguire la configurazione per acquisire l'immagine. Una volta completata l'imaging, rimuovere la piastra dallo stadio del microscopio e sostituire il supernatante di coltura con un millilitro di 1X MEMFA per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente, facendo attenzione a registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratelli all'inizio dell'incubazione. La visualizzazione di un grafico composito contenente tracce per tutte le cellule registrate in un esperimento rivela il grado in cui le misurazioni della massa o della popolazione possono oscurare modelli più sfumato di comportamento di spiking.
Quando i profili registrati delle singole cellule sono isolati, è possibile identificare chiaramente esempi dell'attività di spiking irregolare caratteristica delle cellule progenitrici neurali. Per quantificare questa complessità, è possibile applicare diversi metodi di analisi dei dati, inclusi diversi parametri per definire un picco. Se le piastre vengono maneggiate approssimativamente o i lavaggi vengono eseguiti troppo forzatamente durante l'ibridazione fluorescente in situ, le cellule possono essere slogate dalle superfici della piastra rendendo impossibile l'abbinamento delle cellule tra le immagini.
Se questa interruzione interessa solo alcune delle celle nel campo visivo, potrebbe comunque essere possibile rilevare e assegnare alcune delle celle all'interno dell'immagine. Tuttavia, la quantità massima di dati viene ottenuta da un esperimento in cui l'ibridazione viene eseguita con attenzione e poche celle vengono perse o riposizionate tra le immagini. I risultati di esperimenti che raccoglieno l'attività del calcio con l'espressione di geni marcatori progenitori neurali possono rivelare numerose associazioni tra specifici modelli di attività del calcio e fenotipi neurotrasmettitori.
Con questi dati, i ricercatori possono sondare le caratteristiche più complesse di questi modelli dinamici di calcio e le relazioni con l'espressione genica piuttosto che essere limitate al semplice conteggio dei picchi.
