Il nostro protocollo in situ è significativo perché fornisce un modo semplice per visualizzare i modelli di espressione genica con una colorazione minima dello sfondo. Questa tecnica rende un protocollo complicato e lungo relativamente facile da eseguire. I suggerimenti e le liste di controllo forniti rendono questo protocollo ancora più facile da eseguire correttamente e riprodurre.
Mentre le tecniche qui mostrate sono specifiche di Astyanax mexicanus, potrebbero probabilmente essere adattate ad altri sistemi di individui di dimensioni comparabili con piccoli aggiustamenti al protocollo. Per prima cosa, usa il nastro da laboratorio colorato per designare fiale e pipette per ogni gene. Usando una pipetta Pasteur, ordina gli embrioni.
Di solito non ci sono più di 12 embrioni per flaconcino, una volta ordinati. Quindi, imposta un bagno d'acqua tremante a 70 gradi Celsius. Estraggono con cura il metanolo nelle fiale degli embrioni selezionati e lo sostituiscono con 500 microlitri di metanolo fresco al 100%.
Lavare brevemente gli embrioni per circa un minuto su uno shaker della piattaforma. Successivamente, reidratare gli embrioni in una crescente concentrazione di 1x PBS con Tween 20 su uno shaker di piattaforma come delineato nel protocollo di testo. Per iniziare, posizionare una piccola guarnizione con un fondo a rete nel bagno d'acqua rotante che è stato preriscaldato a 70 gradi Celsius.
Inserire le aliquote del buffer di ibridazione meno e il buffer di ibridazione più nella guarnizione. Aggiungere delicatamente una soluzione di PK preparata alle fiale degli embrioni assicurando che tutti i tessuti siano completamente coperti in soluzione. Trasferire i flaconcini su uno shaker a piattaforma e lasciarli digerire nella soluzione di lavoro proteinasi K per circa 12 minuti.
Successivamente, estraggono delicatamente la soluzione PK e inondano brevemente il flaconcino con PBT per diluire la chiave di piattaforma rimanente. Sostituire la soluzione PBT con 500 microlitri di PBT fresco e lasciare risciacquare la soluzione sullo shaker della piattaforma per cinque minuti. Sostituire quindi la soluzione PBT con 500 microlitri di PFA scongelato al 4%. Lasciare che gli embrioni incubano sullo shaker della piattaforma a temperatura ambiente per 20 minuti.
Per iniziare la pre-ibridazione, aggiungere 500 microlitri di tampone di ibridazione prebellico meno la soluzione alle fiale contenenti embrioni. Posizionare con cura le fiale nella guarnizione nel bagno d'acqua a 70 gradi Celsius senza tremare per cinque minuti. Quindi estraggono il buffer di ibridazione meno la soluzione e inondano i flaconcini con 500 microlitri di buffer di ibridazione prebellico più soluzione.
Riposizionare le fiale nella guarnizione nel bagno d'acqua e incubare con tremori per quattro ore o durante la notte. Per iniziare l'ibridazione, disegnare il buffer di ibridazione più dalle fiale e sostituirlo con 500 microlitri di nuovo buffer di ibridazione prebellico plus. Aggiungere con cura due microlitri di sonda RNA a ciascuna fiala e ruotare delicatamente per garantire una distribuzione uniforme della sonda.
Incubare nel bagno d'acqua a 70 gradi Celsius durante la notte mentre si trema a 40 giri/min. Per iniziare, preparare tubi di microcentrifugo etichettati buffer di ibridazione più con il gene di interesse sonda RNA come delineato nel protocollo di testo. Impostare due tubi conici da 15 millilitri e aggiungere 0,2 grammi di reagente bloccante e 10 millilitri di MABT.
Posizionare entrambi i tubi su un miscelatore di nutating fino a quando il reagente non viene completamente sciolto nella soluzione. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro estraggono il tampone di ibridazione più e sonda la soluzione e la posizionano in un tubo di microcentrifugo etichettato sterile. Conservare questo tubo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro.
Aggiungere con cura 500 microlitri del citrato di sodio salino caldo e del tampone di ibridazione meno diluizioni. Incubare in soluzioni sequenziali per 10 minuti ciascuna nel bagno d'acqua tremante, quindi a temperatura ambiente su uno shaker della piattaforma come delineato nel protocollo di testo. Dopo l'ultima incubazione, sostituire il 100%PBT da ogni flaconcino con 500 microlitri di MABT.
Ripetere questo processo due volte per cinque minuti ciascuno. In primo luogo, rimuovere il MABT da ogni flaconcino e inondarlo di soluzione di blocco premiscelata da uno dei tubi conici da 15 millilitri. Posizionare entrambe le fiale sul miscelatore di nutating per quattro ore a temperatura ambiente.
Aggiungere due microlitri dei frammenti di anticorpo al secondo tubo di soluzione di blocco preparata e brevemente vortice. Quindi riempire ogni fiala quasi completamente con soluzione di blocco e posizionarle su un miscelatore di nutating durante la notte in frigorifero a quattro gradi Celsius. Per iniziare, preparare una fiala stock del 10%NGS in MABT.
Sostituire la soluzione di blocco in ogni flaconcino con 500 microlitri di questa soluzione NGS. Incubare a temperatura ambiente sullo shaker della piattaforma per 25 minuti. Successivamente, sostituire la miscela NGS con 500 microlitri del 100%MABT.
Incubare sullo shaker della piattaforma a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo risciacquo altre 11 volte durante il giorno, ogni 30 minuti. Quindi riempire ogni fiala con 100%MABT e posizionarli su un mixer di nutating durante la notte in frigorifero a quattro gradi Celsius.
In primo luogo, sostituire il MABT in ogni flaconcino con un millilitro di tampone AP e lasciarlo lavare per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio due volte per rimuovere completamente il MABT. Sostituire quindi il buffer AP con un millilitro di tampone PA fresco contenente 3,5 microlitri di BCIP e 4,5 microlitri di MBT.
Sostituirlo con una nuova miscela di tampone AP contenente il BCIP e l'MBT ogni ora fino al completamento della reazione, assicurandosi di monitorare attentamente la reazione e controllare ogni 15 minuti fino a raggiungere il livello desiderato di colorazione. Interrompere la reazione di colorazione risciacquando gli embrioni in una concentrazione crescente di 1X PBT nel buffer AP come delineato nel protocollo. Risciacquare gli embrioni in circa cinque millilitri di 100%PBT su un miscelatore di nutating fino a raggiungere la colorazione minima di fondo desiderata.
Al termine del risciacquo, lavare gli embrioni in 500 microlitri di PBS sterile su uno shaker a piattaforma e postfissare i campioni come delineato nel protocollo di testo. Dopo aver risciacquato gli embrioni, posizionarli in quattro millilitri di PBS sterile al 100% e, se necessario, conservarli a lungo termine a quattro gradi Celsius. In questo studio i campioni embrionali di Astyanax sono etichettati per l'analisi dell'espressione genica di alta qualità.
Questo processo è stato implementato con successo sia nel pesce grotta pachon che negli embrioni di pesce di superficie. Gli embrioni di pesce grotta etichettati per l'espressione Sox9 dimostrano un'etichettatura chiara negli archi branchiali in via di sviluppo e nella pinna pettorale. Si noti che la colorazione è praticamente assente nel sacco vitellino o nei somiti in via di sviluppo sul fianco.
Allo stesso modo, l'espressione di Tfap2a è evidente nelle porzioni della testa in via di sviluppo come cellule della cresta neurale di migrazione precoce lungo la regione del fianco dorsale dell'embrione. Il terzo gene presentato per gli embrioni di pesce grotta, Phf20a, è visto nelle porzioni del mesoderma somatico e della testa posteriore che sono destinate a dare origine a tessuto osseo. Gli embrioni di pesce di superficie etichettati per CXCR mostrano un'etichettatura positiva in regioni isolate della testa e del fianco, così come alcune singole cellule che sovrascrivano il sacco del tuorlo.
Il gene Adcyap1a è espresso nelle regioni del sistema nervoso centrale comprese le cellule ipofisarie. Si noti l'espressione altamente specifica in ammassi bilaterali accoppiati di cellule sull'aspetto dorsale dell'embrione, così come una regione più ampia di espressione della linea mediana. L'ultimo gene esaminato per gli embrioni di pesce grotta, Sox10, è evidente come un primo marcatore della cresta neurale sui lati sinistro e destro dell'embrione dorsale.
Dopo aver completato in situ, in genere immaginiamo i nostri risultati utilizzando la microscopia a luce. È meglio farlo entro due settimane dal completamento per evitare il degrado della colorazione.
