Solo e solo le proteine leganti controllano più processi biologici. Questo metodo FLAG-Biotin CLIP-seq, quindi per profilare globalmente la disposizione speciale e temporale di RTA e RRP nelle cellule di mammifero. Questo metodo consente un rilevamento efficiente degli RNA diretti legati alle proteine senza SDS-PAGE e delle procedure di trasferimento della membrana.
Rispetto al tradizionale CLIP-seq è privo di isotopi e non richiede anticorpi specifici per proteine. Inizia placcando circa 3 milioni di cellule staminali embrionali di topo in una piastra di 10 centimetri e incubandole durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo con un vuoto e trattare le cellule con due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA per due minuti a temperatura ambiente.
Tempra la triptina con quattro millilitri di mezzo MESC fresco e trasferisci le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Quindi, centrifugarli a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il supernatante. Sospendere le celle in quattro millilitri di PBS freddo e trasferirle di nuovo nella piastra di 10 centimetri per il cross-linking.
Irradiare le cellule con una luce UV di 254 nanometri, quindi trasferire le cellule collegate incrociate in un tubo da 15 millilitri. Far girare queste cellule a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il supernatante e lisciviare le cellule con 500 microlitri di Buffer A preparati secondo le indicazioni manoscritte. Trasferire le cellule in un tubo di 1,5 millilitro privo di RNAse e incubarle a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per 30-60 minuti.
Trattare il lisato con 30 microlitri di DNAsi 1 a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo quattro microlitri di EDTA molare 0,5. Spingi il pellet insolubile centrifugando a 12.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo prerimente refrigerato da 1,5 millilitri.
Trasferire il lisato cellulare in perline FLAG prealibrate e incubare il campione a quattro gradi Celsius mentre si ruota per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le perline per due minuti a 3000 volte G e rimuovere il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di Buffer A al campione e incubare a 4 gradi Celsius per cinque minuti, quindi girare giù per le perline e rimuovere il supernatante.
Ripetere il lavaggio con buffer A, seguito da due lavaggi con un'elute Buffer B.To pre refrigerata con un peptide X FLAG, preparare la soluzione di eluizione come descritto nel manoscritto testuale e far girare le perline FLAG. Rimuovere il supernatante con una punta di pipetta a estremità stretta e aggiungere 200 microlitri della soluzione di eluizione X FLAG a ciascun campione. Incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata.
Quindi girare giù le perline per due minuti a 3000 volte G.Trasferire il supernato su un tubo fresco e ripetere l'eluizione due volte. Salvare il 5% degli eluenti per l'analisi western della macchia o la colorazione dell'argento per verificare l'efficienza dell'immunoprecipitazione FLAG. Trasferire gli eluenti tirati su perline di streptavidina preparate e ruotare delicatamente i campioni a quattro gradi Celsius per una o tre ore o durante la notte.
Quindi, raccogliere le perline su un supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer C con rotazione delicata per cinque minuti per lavaggio. Successivamente, lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer D e due volte con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato, raccogliendo le perline sul supporto magnetico e rimuovendo il supernatante tra un lavaggio e l'altro.
Per eseguire la digestione parziale dell'RNA, aggiungere 100 microlitri di soluzione MNA a ciascun campione e vortice impostato a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Quindi, lavarli con tampone PNK-EDTA, buffer C e buffer PNK secondo le indicazioni del manoscritto.
Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere il mix di reazione CIP e vortice le perline a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Lavare rapidamente le perline due volte con 500 microlitri di tampone PNK EDTA ghiacciato, seguiti da due lavaggi con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato.
Dopo i lavaggi, aggiungere 40 microlitri di tre primi mix di legatura del linker alle perline e vortice a 16 gradi Celsius con un miscelatore termico per tre ore o durante la notte. Una legatura efficiente del linker agli alleati è fondamentale per questo esperimento. Controllare occasionalmente il tubo di reazione per assicurarsi che questi non precipitino durante la legatura.
Dopo l'incubazione, ripetere i lavaggi con tamponi PNK EDTA e PNK, aggiungere 40 microlitri di PNK mescolati alle perline e vortice a 37 gradi Celsius con il miscelatore termico per 10 minuti. Lavare le perline con tamponi PNK EDTA e PNK, quindi procedere con l'isolamento dell'RNA come descritto nel manoscritto testuale. Rispetto alla purificazione mediata da FLAG o streptavidina in un solo passaggio, la purificazione tandem FLAG-Biotina ha rimosso quasi tutte le proteine purificate del nucleo, evitando la contaminazione delle interazioni indirette dell'RNA proteico.
LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq è stato eseguito utilizzando cellule staminali embrionali del topo. In totale, sono state recuperate circa 7,7 milioni e 2,2 milioni di letture univoche rispettivamente per LIN28 e WDR43. Il confronto delle viste della traccia mostra diversi modelli di rilegatura nel locus RN45 pre-rRNA.
I siti cross-linked sul motivo GGA G di RNA pre-let7-g di LIN28, Fbio CLIP-seq o identificati. Inoltre, sono stati determinati motivi di RNA arricchiti nei siti di legame e la percentuale di nucleotidi mutati in diversi tipi di mutazioni. Dimostrando che LIN28 preferisce legarsi al nucleotide genico.
Bene, alle 22:00, questo protocollo, è importante confermare l'efficienza dell'immunoprecipitazione per assicurarsi che solo i complessi proteici siano stati purificati con successo.
