Questo metodo fornisce un modo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. Consente inoltre di valutare gli effetti della manipolazione genetica e farmacologica sulla crescita e lo sviluppo del fegato. Questa tecnica fornisce un modo rapido e preciso per visualizzare e misurare il fegato, nonché l'intestino e il pancreas.
Oltre a quantificare le dimensioni del fegato, questo metodo di dissezione può essere utile per preparare il fegato, l'intestino e il pancreas per l'ibridazione in situ o l'imaging confocale. Prima di tentare la deskinning sulle larve sperimentali, assicurati di aver trascorso molto tempo a esercitarti su campioni non sperimentali e di avere un tasso di successo significativo. È fondamentale visualizzare il corretto orientamento e movimento delle larve e delle forcep di zebrafish al fine di rimuovere la pelle senza disturbare gli organi circostanti.
A tre o sette giorni dopo la fecondazione, dopo aver eutanasiato le larve, utilizzare una pipetta di vetro e una pompa pipetta per raccogliere fino a 15 larve in un tubo da due millilitri. Lavare le larve due volte con un millilitro di 1X PBS freddo sul ghiaccio. Rimuovere il più PBS possibile utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta e aggiungere un millilitro di PFA freddo al quattro per cento in PBS.
Incubare a quattro gradi Celsius almeno durante la notte con un dolce dondolo. Utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta, rimuovere il PFA dal tubo e risciacquare tre volte con un millilitro di PBS freddo. Rock per cinque minuti tra un risciacquo e l'altro.
Pipetta diverse larve in PBS in un pozzo di nove ben fondo piatto di vetro rotondo. Al microscopio, rimuovere la pelle che circonda il fegato usando forcep fini per tenere una larva sulla schiena, afferrando entrambi i lati della testa il più delicatamente possibile. Quindi usa forcep molto fini nell'altra mano per afferrare la pelle appena sovrascriva il cuore.
Tirare la pelle verso il basso diagonalmente verso la coda del pesce nella parte inferiore del piatto sul lato sinistro o destro del pesce. Ripetere per l'altro lato. Continuare ad afferrare lembi di pelle e tirare verso il basso fino a quando tutta la pelle e i melanofori sovrastante o vicino al fegato sono stati rimossi.
Se il tuorlo è presente per cinque o sei giorni di larve post-fecondazione, sollevare il tuorlo in un unico pezzo tenendo il pesce con forcep fini sulla schiena e usando le forcep molto fini per pungere delicatamente il tuorlo. Per tre o quattro larve DPF, tenere il pesce con forcep fini sulla schiena e utilizzare le forcep molto fini per accarezzare il tuorlo a partire dal lato ventrale. Raschiare il tuorlo a pezzi.
Posizionare le larve sezionate in PBS fresco e freddo in un tubo da due millilitri utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta. Per montare le larve, versare alcuni millilitri di metilcellulosa al tre per cento sul coperchio di una piastra di Petri pulita e plastica. Utilizzare una pipetta di vetro e una pompa di pipetta per aggiungere larve alla metilcellulosa, aggiungendo il meno PBS possibile con le larve.
Sotto un microscopio sezionato a basso ingrandimento, utilizzare forcep fini per orientare il pesce in modo che siano sdraiati sul lato destro rivolto a sinistra. Conferma che il pesce da fotografare sia perfettamente allineato con un occhio direttamente sopra l'altro occhio. Se la coda del pesce è piegata, rimuovere la coda pizzicandola con forza con le forcep per rimuoverla in modo che il pesce giace piatto.
Ingrandisci ad alto ingrandimento e concentrati sul fegato, assicurandoti che il contorno del fegato sia chiaramente visibile. Premere il pulsante Acquisisci immagine per ancorare un'immagine e salvare il file. Ripetere per tutti i pesci, assicurandosi che l'ingrandimento sia lo stesso per ogni immagine.
Scatta una foto di un micrometro usando lo stesso ingrandimento. Per utilizzare il programma R per accecare tutte le immagini del fegato per evitare potenziali pregiudizi degli investigatori e promuovere il rigore scientifico, rinominare i file in modo casuale e creare un file di randomizzazione contenente un elenco dei nomi di file originali e corrispondenti nomi di file accecati. Aprire i file randomizzati in ordine, a partire dal file uno.
Scegliere lo strumento Selezioni a mano libera e delineare ogni fegato. Premere Ctrl-M per misurare l'area di ogni fegato. Per tutti i fegati che non possono essere misurati con precisione perché hanno pelle residua, tuorlo, sono fuori fuoco o non sono intatti, inserire una misurazione segnaposto.
Salvare le misure in un file di testo. Per dislinare e analizzare i dati, aprire il file di misurazione e il file di randomizzazione in un programma di fogli di calcolo. Inserire una nuova colonna nel file di misure e aggiungere i nomi di file originali per i file accecati utilizzando il file di randomizzazione.
Salvare il file come file Misure non conciate. Ordinare i dati in base al nome del file originale. Escludere eventuali misurazioni del fegato per le quali le immagini non erano adeguate.
Se necessario, convertire i valori di misurazione nella scala desiderata in millimetri quadrati. Aprire la barra Scala nel software di elaborazione delle immagini. Utilizzare lo strumento Linea retta per misurare un millimetro sulla barra di scala.
Il software di elaborazione delle immagini misura quindi nelle stesse unità dei fegati, dando un fattore di conversione. Utilizzate il fattore di conversione per convertire le misurazioni nel file Misure non conociate. Determinare la deviazione media e standard e calcolare i valori P.
A sei giorni dalla fecondazione, le larve di zebrafish non transgeniche mostravano la posizione naturale e la forma del fegato che sovrastava l'intestino. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato rispetto ai loro fratelli non transgenici. Qui vengono mostrati alcuni esempi di immagini e micrometri inadeguati.
Larva con la pelle che copre il fegato, larva con tuorlo che oscura il fegato, larva con parti del fegato pizzicate e larva con fegato lussato e cadente, larva con fegato mancante, larva con contorno epatico difficile da identificare e larva con posizionamento improprio. Quando si tenta questa procedura, è importante utilizzare movimenti piccoli e controllati per prevenire danni al fegato. Oltre alla microscopia a campo brillante, possiamo anche usare larve sezionate in questo modo, per microscopia confocale, per visualizzare proteine reporter fluorescenti o colorazione immuno-fluorescente e per l'ibridazione in situ.
La formaldeide o PFA è un agente cancerogeno irritante e sospetto. I guanti devono essere indossati durante la manipolazione della PFA e le soluzioni concentrate devono essere maneggiate in una cappa aspirante chimica.
