We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

Zebrafish (ceppo madreperla) sono stati allevati e cresciuto secondo i protocolli stabiliti. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza, con 0,4 Tricaine mM per l&#39;anestesia e 1 Tricaine mM per l&#39;eutanasia. Zebrafish embrioni e larve sono state gestite in stretto accordo con le buone pratiche animale come approvato dalla commissione competente (Laboratorio MDI Biological animale nucleo IACUC numero 13-20). Questo studio è stato approvato dall&#39;Istituto Human Genome Research cura degli animali e uso Comitato Nazionale, MDIBL istituzionale Assurance # A-3562-01 sotto protocollo # 14-09. Nota: La procedura di imaging in grado di catturare la rigenerazione pinna zebrafish larvale è riassunta nei seguenti punti: 1. Raccolta di Zebrafish di stadi larvali <ol><li> Raccogliere le uova e mettere circa 50 uova in una capsula di Petri di 100 x 25 mm contenente 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata integrato con 0,00004% blu di metilene. Incubare O / N in un incubatore a 28.5 °. </li> &lt;li&gt; Il mattino dopo rimuovere gli embrioni morti con una pipetta di vetro e lavare le uova in un colino con il 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata (medio dell&#39;embrione chiamato). Nota: Media come Ringers 18, Hanks 18, E2 19, E3 20, e Danieau 21 può essere preferibile. </li><li> sup&gt; Aggiungi medio embrione fresco al piatto. Se utilizzando ceppi pigmentati, opzionalmente aggiungere 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), come PTU impedirà melanogenesi e quindi la pigmentazione delle larve. Lasciate che gli embrioni si sviluppano ulteriormente in incubatrice fino a 2 giorni dopo la fecondazione o qualsiasi altra fase larvale desiderato. </li></ol> 2. Preparazione di sezione Imaging <ol><li> Metodo 1: Imaging camere in PVC o tubi in Teflon (Figura 1) Nota: Questo metodo è simile a Concha e Adams (1998) 22. <ol><li> Acquisire grado di plastica di acqua potabile o di tubi in Teflon da un negozio di ferramenta con una esterna 25 millimetrida 20 millimetri di diametro interno. Tagliare il tubo per fare anelli di circa 10 mm di spessore con una superficie piana su ogni lato. Utilizzare&gt; 200 carta vetrata a grana per lisciare i bordi. </li><li> Pulire gli anelli con acqua calda e il 70% di etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Con un puntale, applicare grasso al silicone alla metà di un anello e fissare l&#39;anello a x 25 mm vetrino di vetro 75 mm. In alternativa, utilizzare una siringa da 3 ml riempita con grasso al silicone al posto di una punta della pipetta. Nota: Poiché è difficile inserire il grasso siliconico nella siringa 3 ml, aggiungere il grasso al silicone in una siringa da 30 ml prima e di utilizzare per il riempimento della siringa 3 ml. </li></ol></li><li> Metodo 2: Preparazione di un piatto Petri come camera di imaging. <ol><li> Acquisire 35 o 60 mm di diametro Petri con un coprioggetto di vetro fissato al coperchio (Figura 2A). In alternativa, come illustrato nella figura 3 Distel &amp; Koester (2007) 23, praticare un&#39;apertura piccola abbastanza da hvecchio un coprioggetto nel coperchio di una piccola capsula di Petri e applicare grasso al silicone all&#39;esterno con una siringa 3 ml. Usando una pipetta pulita, applicare accuratamente una rotonda o quadrata coprioggetto di spessore desiderato verso l&#39;esterno (Figura 2B). </li></ol></li><li> Per garantire che l&#39;agarosio utilizzato per soggiorni saldamente attaccati durante la procedura di imaging di montaggio, collegare una rete di plastica multa all&#39;interno dell&#39;anello. In primo luogo, tagliare la maglia fatta di schermo di finestra ottenuto da un negozio di ferramenta, nella dimensione del diametro dell&#39;anello interno con le forbici bene con un angolo. Poi tagliare un piccolo rettangolo&gt; due volte la dimensione della larva al centro della maglia (figura 1, 2). </li><li> Applicare quattro piccoli punti di grasso al silicone non tossico per l&#39;interfaccia tra il vetrino e l&#39;anello camera (Figura 1A). </li><li> Usare pinze per fissare la maglia saldamente al fondo del vetrino di vetro. </li></ol> 3. Montaggio e imaging del Pre-injrato Larva (questo passaggio è facoltativo) Nota: Questo passaggio è adatto per il confronto tra la lunghezza della pinna amputata e rigenerata, mentre l&#39;aereo amputazione dopo la rigenerazione pinna non è riconoscibile in larve di zebrafish. <ol><li> Preparare una soluzione di agarosio 0.5-1.2% bassofondente nel mezzo embrioni per l&#39;immobilizzazione del campione. </li><li> Riscaldare l&#39;agarosio in un forno a microonde e trasferire il liquido in agarosio 1,5 ml tubi che vengono pre-riscaldato a 42 ° C in un blocco di riscaldamento. </li><li> Sia l&#39;agarosio calda raffreddare a 42 ° C, che può essere mantenuta per diverse settimane a questa temperatura. Cercate di evitare pipettare le larve in agarosio sopra 42 ° C, in quanto questo sarà dannoso per gli animali. </li><li> Anestetizzare vari larve utilizzando 10 ml di 0,4 Tricaine mM (pH 7) in mezzo embrione in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Preparare il Tricaine secondo le Zebrafish libro Ricette 18. <ol><li> In alternativa, utilizzare 10 ml di una diluizione 1: 1000 99% 2-fenossietanolo in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Poke le larve con una punta microloader pipetta capped per valutare la loro risposta al tocco prima di procedere. Utilizzare solo le larve non risponde. </li></ol></li><li> Trasferire una larva nel C soluzione di agarosio 42 ° con una pipetta Pasteur di vetro. Non trasferire il liquido eccessivo nella agarosio, altrimenti il ​​agarosio sarà troppo diluito e non solidificare. </li><li> Eliminare il liquido rimanente dalla pipetta e trasferire la larva con una goccia di agarosio in una piccola scatola di Petri (35 o 60 mm di diametro). Posizionare la larva su un lato per l&#39;imaging della pinna caudale. </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare. Valutare l&#39;agarosio con una pipetta di plastica; la punta si immergono nel agarosio se è troppo liquido. Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, una piccola rientranza sarà visibile dopo aver toccato con la punta della pipetta. A seguito di solidificazione, aggiungere la soluzione Tricaine e procedere alla stereomicroscopio che verrà utilizzato in seguito per l&#39;imaging time-lapse. <li> Utilizzare uno stereomicroscopio con software time-lapse. Selezionare un obiettivo e l&#39;ingrandimento del caso, che sarà utilizzato in seguito per l&#39;imaging time-lapse. Qui, utilizzare un 3.5 x 16 millimetri, distanza di lavoro lente obiettiva su uno stereomicroscopio. Come desiderato, utilizzare microscopi alternativi e lenti dell&#39;obiettivo, ma scegliere un ingrandimento adeguato per tenere conto di potenziali xy-drift e la crescita della pinna durante la procedura di imaging. </li><li> Selezionare la modalità di rilevazione telecamera sul microscopio. </li><li> Nel software, selezionare la modalità &#39;live&#39; per vedere la larva sullo schermo. </li><li> Aprire la finestra &#39;Proprietà&#39; per rilevare automaticamente la luminosità. </li><li> Regolare manualmente il contrasto al microscopio trans-illuminazione di base. </li><li> Spostare la larva fuori del campo visivo e selezionare la funzione Correzione Shading per minimizzare sfondo noise. </li><li> Posizionare la larva di nuovo nel campo visivo e scattare una foto. Salvare l&#39;immagine. </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio dalla larva dalla prima raschiando il agarosio la testa. In questo modo la larva può essere scivolato fuori dal agarosio tirando delicatamente la testa dal agarosio rimanente con una ridotta punta microloader pipetta o un perno insetto. </li><li> Con una pipetta Pasteur di vetro trasferire la larva in soluzione Tricaine fresco. </li></ol> 4. Amputazione Assay <ol><li> Preparare una soluzione di agarosio 1,5% con media embrione e versare uno strato sottile in una capsula di Petri. Lasciate che il agarosio solidificare. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, posizionare il sideward larva sul agarosio solidificato e amputare la pinna di coda con un G siringa 23 con una leggera pressione (Figura 3A). </li></ol> 5. Montaggio del Larva per Time-lapse imaging <ol><li> Procedere come descritto nei passaggi 3,1-3,5 (Figura 3B). </li><li&gt; Trasferire un calo del 0,5-1,2% agarosio liquido a 42 ° C contenente la larva nell&#39;anello camera di imaging (passo 2,1), orientare la larva e lasciare che il agarosio solidificare. Riempire l&#39;anello con soluzione Tricaine. In alternativa, se la camera di scatola di Petri (punto 2.2) è utilizzato, montare la larva sul vetrino coperchio e riempire il coperchio con la soluzione Tricaine. </li><li> Per consentire una corretta guarigione della ferita o la rigenerazione dei tessuti a verificarsi, raschiare con cura l&#39;agarosio circonda la pinna caudale distale con un tappo tip microloader pipetta o un perno insetto. Cercate di non danneggiare la pinna ripetutamente (Figura 3C). </li><li> Decantare la soluzione Tricaine contenente il rimosso agarosio e riempire l&#39;anello da camera con soluzione Tricaine fresca. </li><li> Applicare grasso al silicone all&#39;inizio dell&#39;anello camera e collegare un x 25 mm vetrino 75 mm. Cercate di evitare sacche d&#39;aria nella camera, in quanto interferiscono con l&#39;imaging campo chiaro e essiccare la larva nel tempo. </li><li> Se si utilizza una capsula di Petri comeuna camera di imaging, applicare grasso al silicone al bordo superiore della camera inferiore e riempire la camera inferiore con soluzione Tricaine. Decantare attentamente la soluzione Tricaine nel coperchio e ruotare il coperchio verso immergere la larva nella soluzione Tricaine della camera inferiore con una leggera angolazione per evitare sacche d&#39;aria. La camera viene sigillato a causa del grasso al silicone. </li></ol> 6. Time-lapse imaging <ol><li> Assemblare una camera di incubazione riscaldata come descritto in 23,24 (figura 4) .Rimontare camera umida intorno al microscopio e accendere il calore. Regolare la temperatura a 28 ° C per circa 10 - 20 min o fino a quando la temperatura si è stabilizzata. </li><li> Aprire la parte anteriore della camera di incubazione riscaldata e posizionare la camera di imaging sul supporto microscopio con coprioggetto rivolto verso l&#39;alto verso l&#39;obiettivo. </li><li> Posizionare la pinna larvale in modo che 2/3 del campo visivo rimane non occupato. Questo assicura la cattura delcrescita e la rigenerazione della pinna nel corso della procedura di imaging senza dover riposizionare la larva. <ol><li> Regolare la larva montato a 28 ° C per ~ 30 minuti prima di iniziare la registrazione time-lapse di evitare cambiamenti di intensità campo chiaro o potenziali spostamenti della agarosio. In alternativa, utilizzare buffer di pre-riscaldato per avviare l&#39;imaging dopo tempo di regolazione più brevi. </li></ol></li><li> Per impostare la registrazione time-lapse, aprire la finestra 6D Multidimensionale acquisizione nel software AxioVision e selezionare l&#39;opzione z-stack e time-lapse. </li><li> Opzionale) Nella scheda z-stack e modalità Slice, selezionare lo spessore della fetta e quindi selezionare la modalità di Start / Stop. </li><li> Definire la posizione superiore e inferiore della pila. </li><li> Nella scheda time-lapse, selezionare l&#39;intervallo e la durata del film e quindi avviare il filmato premendo il pulsante di avvio. Abbiamo scoperto che intervalli di 30 min sono sufficienti e questo intervallo non genera dati eccessivo; tuttavia shortepossono essere utilizzati intervalli r. </li><li> Controllare le dimensioni di posizione e z-stack durante la prima ora, se la larva non è stato pre-regolato. Se necessario, riposizionare la larva dopo un giorno, come la larva può essere spostato. </li><li> Salvare il file alla fine della registrazione time-lapse e procedere con la post-elaborazione e quantificazioni utilizzando disponibili software di analisi dell&#39;immagine, come ad esempio Imaris 25 o l&#39;open source software Immagine J 26 e 27 Fiji. </li></ol> Analisi 7. I dati <ol><li> Determinare la lunghezza della pinna. <ol><li> Aprire il filmato time-lapse nel software di imaging e salvare i file nel formato file proprietario per migliorare le prestazioni del software. </li><li> Selezionare la vista ortogonale per visualizzare le sezioni individuali come stack proiettate. Per la correzione della deriva, sotto il menu Fiji, selezionate Plugin, quindi registrazione, e &#39;corretto deriva in 3D&#39;. Si aprirà una finestra Fiji ed effettuare le correzioni di deriva. Correttoderiva di rotazione in funzione Spots Imaris. In alternativa, installare i plugin StackReg e TurboReg in immagine J e importare a Fiji. Scegliere l&#39;algoritmo trasformazione desiderata nel plugin StackReg. </li><li> Per misurare le distanze (ad esempio, diametro della ferita o lunghezza fin), selezionare l&#39;opzione &#39;aggiungere nuovi punti di misura &quot;nella barra degli strumenti in alto a sinistra. <ol><li> Sotto &#39;lista Configura Statistiche visibili valori&#39; nel menu in basso a sinistra, selezionare i valori delle statistiche da visualizzare. </li><li> Nella &#39;Modalità Line&#39; nella scheda Impostazioni selezionare &#39;Pairs (AB, CD ...). </li><li> In &#39;Etichette Proprietà&#39; select &#39;Nome&#39; e &#39;Distance&#39;, per mostrare la distanza tra i punti A e B accanto alla linea di misura. </li><li> Passare alla modalità &#39;Modifica&#39; e tenere premuto il tasto Maiusc per selezionare il primo punto alla fine della notocorda. Quindi utilizzare la stessa configurazione per selezionare il secondo punto sul margine distale della pinna. </li><li> Nella scheda &#39;Statistiche&#39;, selezionare il pulsante del disco (Esporta tutto) in basso a destra per visualizzare ed esportare la distanza nell&#39;immagine. </li><li> Ripetere le misurazioni a volte selezionati spostando il cursore sotto l&#39;immagine a destra. Invece di creare nuovi punti di misura, quelli precedenti possono essere riposizionati selezionando prima il punto con il tasto sinistro del mouse, quindi contemporaneamente premendo il cambio e il tasto sinistro del mouse nella nuova posizione. </li></ol></li><li> In alternativa all&#39;opzione punti di misura, utilizzare lo spettatore fetta per misurare le distanze. Nella modalità di visualizzazione fetta, scorrere fino alla posizione desiderata e fare clic sulla prima e seconda posizione con il tasto sinistro del mouse. Verrà visualizzata la distanza. Questa opzione però non consente l&#39;esportazione di dati. </li></ol></li><li> Determinare la lunghezza della pinna e l&#39;area in ImageJ. <ol><li> Aprire il filmato time-lapse in ImageJ utilizzando un plugin che riconosce il formato di file .zvi. In alternativa, caricare in un Qufile di ickTime o una sequenza tiff. Nota: Se si utilizza un formato di file TIFF non compresso, le dimensioni dell&#39;immagine non devono essere specificati. </li><li> Se l&#39;apertura di un formato di file diverso senza le informazioni sul file, selezionare &#39;Set Scale&#39; nel menu &#39;Analizza&#39; per definire prima la distanza dell&#39;immagine e l&#39;unità. Nel &#39;Set menu Scala&#39;, digitare il &#39;Distanza in pixel&#39;, sotto digitare la &#39;distanza nota&#39; per il valore di pixel (questo può essere ottenuto misurando il numero di pixel su una barra di scala che è stato aggiunto all&#39;immagine , quindi fare clic su Misura per ottenere il risultato), e la &#39;Unità di lunghezza&#39; (tipicamente &#39;micron&#39;). Quindi fare clic su OK. </li><li> Per pinna misurazioni dell&#39;area selezionare lo strumento &#39;selezione a mano libera&#39; nella barra degli strumenti e delineano l&#39;area fin tenendo premuto il tasto sinistro del mouse mentre si disegna lungo il contorno della pinna. Per le misure di lunghezza pinna, selezionare la &#39;dritta&#39; strumento linea e tracciare una linea tra i punti desiderati per esseremisurata. </li><li> Selezionare l&#39;opzione &#39;Misura&#39; sotto &#39;Analizza&#39; per visualizzare l&#39;area e la lunghezza della pinna. Ripetere questo passo con la frequenza necessaria per più punti di tempo del film. </li></ol></li><li> Utilizzando le statistiche software i dati possono essere visualizzati graficamente. </li></ol>

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	<li>San Miguel-Ruiz, J. E., Garc&#237;a-Arrar&#225;s, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+cellular+events+occur+during+wound+healing+and+organ+regeneration+in+the+sea+cucumber+Holothuria+glaberrima.">Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima.</a> BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).</li><li>Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+of+regeneration+in+zebrafish.">Tales of regeneration in zebrafish.</a> Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).</li><li>Akimenko, M. A., Mar&#237;-Beffa, M., Becerra, J., Old G&#233;raudie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+questions,+new+tools,+and+some+answers+to+the+mystery+of+fin+regeneration.">Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration.</a> Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).</li><li>Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+research+today.">Regeneration research today.</a> Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).</li><li>Seifert, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+(Acomys).">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561-565 (2012).</li><li>Goss, R. J., Grimes, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+downgrowths+in+regenerating+rabbit+ear+holes.">Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes.</a> J Morphol. 146, 533-542 (1975).</li><li>Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ear+tissue+regeneration+in+mammals.">Comparison of ear tissue regeneration in mammals.</a> J Anat. 149, 55-63 (1986).</li><li>Allan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+response+and+Msx1+expression+after+human+fetal+digit+tip+amputation+in+vitro.">Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro.</a> Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Dev Biol. 315, 125-135 (2008).</li><li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine.">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+induction+of+four+msx+homeobox+genes+during+fin+development+and+regeneration+in+zebrafish.">Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish.</a> Development. 121, 347-357 (1995).</li><li>Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+tip+regeneration+correlates+with+regions+of+Msx1+(Hox+7)+expression+in+fetal+and+newborn+mice.">Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice.</a> Development. 121, 1065-1076 (1995).</li><li>Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+development+of+skin+cells+and+cutaneous+sensory+axons+in+zebrafish.">Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).</li><li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration.">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).</li><li>Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+functional+analysis+of+zebrafish+larval+fin+fold+regeneration.">Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration.</a> Dev Biol. 325, 71-81 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish:+Cellular+and+Developmental+Biology,+part+A.+Preface.">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface.</a> Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).</li><li>Dahm, N. -. V. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , 303 (2002).</li><li>Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. , (2005).</li><li>Concha, M. L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+divisions+and+cellular+morphogenesis+in+the+zebrafish+gastrula+and+neurula:+a+time-lapse+analysis.">Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis.</a> Development. 125, 983-994 (1998).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Heated+Incubation+Chamber+around+a+Microscope+Stage+for+Time-Lapse+Imaging.">Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bitplane.">Bitplane.</a> Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Processing with ImageJ. , 36-42 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Mateus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+and+tissue+dynamics+underlying+zebrafish+fin+fold+regeneration.">In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration.</a> PLoS One. 7, e51766 (2012).</li><li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons.">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li><li>Tadrous, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+PSF+generation+for+3D+brightfield+deconvolution.">A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution.</a> J Microsc. 237, 192-199 (2010).</li><li>Distel, M., Babaryka, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+in+vivo+time-lapse+imaging+at+cellular+resolution+by+stereomicroscopy.">Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy.</a> Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo presentato permette di osservare la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti nel vivere larve zebrafish con in vivo time-lapse imaging su uno stereomicroscopio chiaro, con un relativamente semplice set-up. Questa procedura richiede alcuni aspetti importanti che abbiamo testato, che ottimizzano il risultato: 1) Basse concentrazioni agarosio (~ 0,5%) ridurrà al minimo gli ostacoli di crescita della continua crescita zebrafish larvale, 2) Rimozione del agarosio intorno alla pinna è importante non oscurare il processo di guarigione, 3) Trapping l&#39;agarosio in una maglia di plastica mantiene l&#39;agarosio e animale in una posizione stabile durante la procedura, e 4) un ambiente a temperatura controllata corretta, che è essenziale per la vitalità delle larve. Abbiamo adattato una camera riscaldata incubazione 23,24, che utilizza involucro di bolla che viene registrato sul cartoncino, e un riscaldatore cupola cablata per controllare la temperatura e la corretta circolazione dell&#39;aria con fluttuazioni minime durante laprocedura di imaging. Questa camera semplice e conveniente può essere preparato per adattarsi a qualsiasi microscopio. Un simile camera di incubazione riscaldata è stato anche utilizzato per i topi di imaging e sviluppo pulcino 24,29. Suggeriamo che le larve pre-amputato sono montati per un&#39;immagine pre-amputazione, smontati per amputazione, e rimontati per l&#39;imaging time-lapse. Anche se è fattibile per eseguire queste operazioni in un unico passo nella camera di imaging finale, nella nostra esperienza abbiamo scoperto che amputare la pinna di coda su un vetrino di vetro non è ottimale, in quanto si strappa il tessuto e non comporta un taglio netto. Il metodo di amputazione basato agarosio-usando un ago della siringa è stato originariamente descritto da Kawakami e colleghi (2004) 16, ed è anche, nella nostra esperienza, ideale per eseguire le amputazioni. Così, la serie piuttosto complessa di passaggi che abbiamo presentato è ben giustificata e garantisce un risultato ottimale rigenerazione. Abbiamo dimostrato che larval zebrafish a 2 dpf può essere ripreso fino a 1,5 giorni in agarosio e soluzione Tricaine. Abbiamo usato pH della soluzione ottimizzata Tricaine (pH7) preparato con sale Instant Ocean, che non interferisce con la salute delle provino per il periodo di imaging presentato. Abbiamo precedentemente però anche dimostrato che l&#39;uso di Tricaine in Danieau medio permette time-lapse imaging di 2,5 dpf zebrafish larvale su un microscopio confocale per almeno 2 giorni 30. Pertanto, le condizioni ottimali tampone possono estendere salute larvale e la lunghezza di imaging. In alternativa, le concentrazioni tricaine inferiori possono essere utilizzati per l&#39;anestesia, o 2-fenossietanolo, che abbiamo trovato è ben tollerata durante stadi larvali e adulti a 28 ° C per almeno 60 ore. Per evitare difetti di rigenerazione pinna, abbiamo rimosso il agarosio dalla pinna caudale prima di imaging. Nostri dati mostrano che entro 1,5 giorni pinna ha rigenerato a circa il 60%. Questo tasso di rigenerazione è coerente con uno studio precedente che definisce 3 giorni as un tempo medio per la rigenerazione pinna caudale in larve di zebrafish fino a 6 dpf 16. Metodi alternativi per agarosio potrebbero comunque essere utilizzate per montare il pesce per imaging. Ad esempio, il plasma sottile coagula 31 o fluorurati etilene propilene (FEP) tubi rivestiti di metilcellulosa e riempiti di concentrazioni molto basse agarosio (0,1%) sono stati raccomandati per foglio microscopia ottica 32 e può essere adatto per il nostro metodo presentato. Tuttavia, non è consigliabile metilcellulosa e 0,1% agarosio, in quanto richiedono che i campioni sono montati nella parte inferiore della camera a causa della mancanza di solidificazione di questi mezzi. Molto alte concentrazioni di metilcellulosa saranno inoltre generare bolle d&#39;aria sulla base della nostra esperienza, e questi possono interferire con la procedura di imaging. Se questi mezzi sono preferiti con utilizzando la camera inferiore, è importante che un&#39;opportuna distanza di lavoro tra la lente obiettivo e il campione è presente. Va notato che metilcellulosa come mezzo di montaggio è consigliato solo per un massimo di 1 giorno, in quanto potrebbe interferire con la salute larvale 32. Montaggio il campione del coperchio può provocare una lenta deriva gravitazionale verso il basso. Si raccomanda pertanto di immagine più sezioni in ogni tempo, che può essere proiettata in un unico piano o solo immagini che si trovano nel piano focale può essere estratto per il montaggio del filmato finale. Imaging il campione alla camera inferiore potrebbe essere un metodo alternativo per evitare potenziali deriva verso il basso. Coaguli plasma potrebbero essere utili al fine di evitare la deriva, come il plasma si attacchi allo strato avvolgente esterna (EVL, periderm) 31 e, pertanto, possono stabilizzare i campioni. Questo però deve essere testato, così come per quanto tempo zebrafish larvale può essere mantenuta in grumi plasma senza interferire con la salute delle larve o la rigenerazione della pinna. Il nostro film è stato assemblato utilizzando singole sezioni (26 micron)di z-stack registrata, che copriva l&#39;intero spessore della pinna (~ 10 micron) e che rappresenta il potenziale z-drift della pinna durante la procedura di imaging. Al fine di conservare le informazioni 3-D, è anche possibile proiettare z-stack in immagini singole. Poiché questo può causare sfocatura dell&#39;immagine, campo chiaro deconvoluzione può desiderare. Software, come Deconvolve o X3 Autoquant potrebbe essere utilizzato per questo scopo. In alternativa, algoritmi matematici (descritti in Tadrous 33) possono essere applicati per ottenere una funzione point-diffusione di alto rapporto segnale-rumore (SNR). Ottenere un elevato SNR rappresenta uno dei principali ostacoli nel campo chiaro deconvoluzione. Anche se questo metodo richiede un elevato contrasto e spessore del campione sottile, sarebbe opportuno per l&#39;imaging della pinna caudale causa della sua larghezza ridotta. Un chiaro vantaggio del metodo di imaging presentato è che è rapidamente adattabile a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCDd software time-lapse e offre un basso costo un&#39;alternativa ai sistemi di imaging confocale più costosi. Mentre questo metodo non utilizza fluorescenza per il rilevamento delle cellule, può essere esteso per tali applicazioni utilizzando un sistema automatico per il controllo dell&#39;otturatore e post-immagini software deconvoluzione 34. Ciò consentirebbe agli utenti di osservare ulteriormente i processi di riparazione e rigenerazione della ferita con singola cella o risoluzione subcellulare su periodi di tempo più lunghi. La chiarezza ottica e la facilità con cui embrionale e larvale zebrafish possono essere gestiti, e l&#39;adattabilità di questo metodo per qualsiasi stereomicroscopio lo rende adatto per l&#39;insegnamento della biologia dei vertebrati di base in classe. Questo metodo può fornire agli studenti una migliore comprensione dei processi biologici fondamentali sottostanti riparazione dei tessuti e la rigenerazione. Altri processi biologici che sono stati catturati con un metodo simile sono zebrafish sviluppo embrionale 23,34 e cardiacafunzione (inedito). Questo metodo offre anche la possibilità per la riparazione e rigenerazione monitoraggio della ferita in larve geneticamente e farmacologicamente manipolato.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
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			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&#34; (Home Depot)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING&#174; HIGH VACUUM GREASE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips 20 &#181;l (Eppendorf, Cat. No. 930001007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe&#160;(BD, Cat. No. 309657)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Discovery.V12 compound microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Plan Apo S 3.5X objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

La tecnica presentato è adatto per chiarire dinamiche riparazione tissutale in risposta all&#39;amputazione. Il film dimostra che amputazione della pinna innesca inizialmente un effetto a borsa di caratterizzata da contrazioni tramite cavi actina-miosina presenti nella pinna volte 28 (Figura 5 A, B). Contemporaneamente, le cellule vengono estrusi dalla ferita (vedi filmato). La contrazione può quindi essere un mezzo per espellere cellule che sono probabilmente destinati a subire morte cellulare. I nostri risultati dimostrano inoltre che la crescita dello sviluppo della larva si verifica indipendentemente rigenerazione (film), mentre la rigenerazione pinna non avvia fino a circa 14 ore dopo l&#39;amputazione, misurata in base alla lunghezza della pinna e l&#39;area nel corso tempo di 36 ore dopo l&#39;amputazione (Figura 5C , D). La crescita fin rigenerativa totale dopo 1,5 giorni è stato circa il 60% della lunghezza della pinna originale (Figura 5E). Presi insieme, questi risultati dimostrano che l&#39;amputazione tr<html> Iggers contrazione pinna, estrusione di cellule dalla ferita, e una risposta rigenerativa temporalmente ritardata. Mentre le cellule estrusi sono probabilmente destinate a subire la morte delle cellule, la natura di queste cellule deve essere ulteriormente chiarita. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> Figura 1. Imaging gruppo anello di camera (A) si riporta un anello di plastica che è collegato a un coprioggetto con grasso al silicone. Una maglia di plastica è attaccato all&#39;interno della camera con quattro piccoli punti di grasso al silicone. (B) La camera contenente la larva montato è riempito con una soluzione Tricaine e un vetrino è attaccato alla parte superiore. (C) Un sospesa 2 giorni di età larva (freccia) è mostrato un ingrandimento maggiore per descrivere la sua dimensione in relazione alla mesh.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> Figura 2. Camera Imaging montaggio fatto da piastre di Petri. (A) si riporta un bicchiere top bottom capsula di Petri di vetro commerciale con una rete di plastica attaccato al coprioggetto di vetro. (B) mostrato è un piatto Petri camera di auto-costruito con un foro nel coperchio e un coprioggetto attaccato dall&#39;esterno con grasso siliconico. La rete e la larva sono montati all&#39;interno della camera contenente soluzione Tricaine. Per sigillare la camera, grasso siliconico è applicato alla tomaia, bordo esterno della camera di fondo e il coperchio superiore fissato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Schema di amputazione e il montaggio di una larva per l&#39;imaging. (A) per amputazione, posizionare un larva anestetizzato su un piatto Petri agarosio rivestite e amputare la pinna di coda con un ago della siringa. (B) Per il montaggio, trasferire la larva con una pipetta di trasferimento in una provetta da 1,5 ml riempito con 42 ° C agarosio liquido e pipetta una goccia contenente la larva nella camera di imaging, orientare il pesce e coprire il solidificato agarosio con media embrione. (C) Raschiare il agarosio dalla pinna caudale con una microloader pipetta punta ridotta o un attrezzo simile e sostituirlo media embrione con terreno fresco. (D) Immagine pinna caudale allo stereomicroscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4. Self-costruito camera di incubazione riscaldata. (AC) si riporta una camera di incubazione riscaldata in cartone, pluriball e velcro. Un riscaldatore cupola cablata (originariamente progettato per uova di gallina incubazione) è collegato alla camera con del nastro di alluminio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> Figura 5. dinamiche di rigenerazione Fin. (A) Schema del metodo amputazione analisi e quantificazione pinna caudale utilizzato per determinare la lunghezza della pinna (freccia rossa) e l&#39;area (contorno rosso della pinna). (B) Tail amputazione fin innesca inizialmente contrazione della pinna, seguito da Regeescrescenza tessuti nerative. La pinna subisce anche la crescita dello sviluppo, come dimostra l&#39;aumento delle dimensioni laterali. (C) è riportata la pinna di lunghezza in funzione del tempo, rivelando una partenza crescita rigenerativa lineare a ~ 14 hpa. (D) Quantificazione dell&#39;area fin rivela un inizialmente diminuire in dimensioni, che può essere attribuito alla contrazione della pinna. Dopo ~ 14 ore, gli aumenti pinna dimensioni a una velocità lineare. (E) Il confronto della lunghezza pinna prima amputazione e dopo 36 ore mostra ~ 60% ricrescita. Scala bar: 100 micron Abbreviazioni: pre-amp, pre-amputazione; ore dopo l&#39;amputazione, hpa; rigenerazione, rigenerazione; amp, amputazione <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">Movie</a> . Fin rigenerazione nel corso del tempo 36hr. Mostrato è una pinna coda di un 2,5 giorni vecchia larva nel corso della rigenerazione. Avvio di 30 min dopo l&#39;amputazione crescita rigenerativa è ripreso in 30 min intervalli su uno stereomicroscopio utilizzando una lente obiettivo 3.5x.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Views.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Video: Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...