Ringraziamo Sean Pelkowski per l&#39;assistenza nella ottimizzazione del test comportamentali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano, R01 HD060647 e il National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 e R03 ES017755.

1. Raccolta di embrioni di zebrafish e Raising Larve <ol><li> Vetro pyrex piatti a base di erba &quot;fake&quot; (realizzato in lana verde) (Figura 1) devono essere inseriti i serbatoi all&#39;alba e lasciati in per due ore al fine di raccogliere embrioni di zebrafish. I piatti di vetro contenenti gli embrioni devono essere gettati su un colino palmare e risciacquati con acqua deionizzata. Gli embrioni devono poi essere coltivate in acqua uovo. L&#39;acqua uovo contiene 60 mg / L di Instant Ocean in acqua deionizzata e 0,25 mg / L di blu di metilene, che è utilizzato come un inibitore stampo. </li><li> A seconda della ipotesi dell&#39;esperimento individuale, gli embrioni possono essere trattati immediatamente o durante specifici stadi di sviluppo utilizzando sostanze tossiche o prodotti farmaceutici. Le sostanze tossiche e farmaceutici sono solitamente disciolti in DMSO (concentrazione 1.000 X) e dovrebbero essere ulteriormente diluiti direttamente nel mezzo acqua uovo. </li><li> Durante il trattamento embrionale e larvale con farmaci o sostanze tossiches, le larve e gli embrioni possono essere alloggiati in piatti profondi Petri con una densità di circa 50-60 larve per 50 ml fino a quando le analisi comportamentali alle 7 dpf (soluzione di acqua uovo deve essere cambiata almeno ogni due giorni per evitare la crescita di funghi / batteri da embrioni morti). </li></ol> 2. Preparazione Stampi per analisi comportamentali <ol><li> Appositamente sviluppato stampi di plastica, che misurano 11,7 centimetri x 7,6 cm x 5 mm sono stati realizzati su misura in-house. Gli stampi sono necessari per creare corsie utilizzando agarosio che viene versato in piatti di plastica e singoli da Thermo Scientific. L&#39;unico provvedimento ben piastre 12,4 centimetri x 8,1 centimetri x 1,2 cm. </li><li> Gli stampi contengono cinque corsie in cui i lati sono inclinati a 60 °. Le corsie in stampi sono 3,5 mm di altezza con una base di 18 mm nella parte superiore, che è la più ampia, mentre la larghezza inferiore è 14 mm. C&#39;è un divario 4 mm tra le corsie nello stampo (Figura 2). </li><li> Per preparare le corsie versare 50 ml di fuso agarosio (0,8% di agarosio in deionizzared acqua con 60 mg / L Instant Ocean) in un unico piatto bene. Lo stampo deve essere messo poi molto lentamente sopra il liquido agarosio per eliminare qualsiasi formazione di bolle e può essere rimosso quando l&#39;agarosio si è raffreddato (che richiede circa 45 min). </li><li> Le corsie agarosio dovrebbero essere non prima di un giorno prima dell&#39;esperimento comportamentale è da eseguire (per evitare l&#39;agarosio essiccazione) Le corsie possono essere conservati a temperatura ambiente con i coperchi sulle stoviglie fino a circa 36 ore. Le corsie agarosio deve essere utilizzato solo per un esperimento e devono quindi essere eliminati. </li></ol> 3. Acquisizione Immagine <ol><li> Fino a 20 larve può essere collocato in ogni corsia delle piastre. Tipicamente 5 larve per corsia sono utilizzati per facilitare il monitoraggio più accurato della velocità nuotata e di ridurre il numero di larve che sono necessari per esperimento. Le corsie possono essere riempiti con acqua uovo con o senza farmaci o sostanze tossiche a seconda dell&#39;esperimento. Tuttavia, corsie non dovrebbero essere filled su tutto il senso fino a quando essi sono posti in armadi di imaging, questo impedirà di overflow. Per coerenza, le larve dovrebbe avere un periodo di acclimatazione di dieci minuti dopo essi sono posti in stampi agarosio e posizionati sulla parte superiore dello schermo del computer portatile. In modo efficiente lo spostamento delle larve dalla piastra di Petri per l&#39;agarosio corsia contribuirà a ridurre lo stress larve. Questo è più facile quando le larve sono alloggiati in vasche poco profonde o piatti di Petri. </li><li> Gli armadi di imaging includono una fotocamera digitale Canon usato per fotografia time-lapse e un computer portatile. La telecamera deve essere posizionato nella parte superiore del mobile, in direzione del fondo del mobile in cui un computer portatile 15,6 pollici schermo deve essere posizionato con schermo rivolto verso l&#39;alto (Figura 3). Quattro piastre devono essere posizionate a mano direttamente sulla parte superiore dello schermo del computer portatile. In questo momento le corsie vengano coronata con acqua uovo o trattamento chimico in modo che sia a livello con la parte superiore della corsia (per eliminare le ombre sui bordi della lAnes nelle immagini). </li><li> Una presentazione PowerPoint è usato come stimolo negativo per le larve. In passato si spostano palle rosse hanno mostrato di larve di zebrafish in 6 o 12 piastre multi-pozzetto 15,17,18. La corrente PowerPoint inizia con uno sfondo bianco bianco per 15 min, seguiti da 15 minuti di una barra rossa movimento sulla metà superiore della piastra (Figura 4). Al fine di eliminare il surriscaldamento delle larve, è meglio per l&#39;acquisto di un computer portatile con una temperatura di schermo che non va oltre i 28 ° C. Per evitare l&#39;evaporazione del liquido all&#39;interno delle corsie di agarosio, il tempo di imaging massimo deve essere mantenuta al di sotto di un&#39;ora. </li><li> La fotocamera digitale deve essere programmata per fotografia time-lapse, scattare foto ogni 6 secondi per un totale di 300 immagini per esperimento. Tuttavia, la frequenza e la lunghezza può essere regolata a seconda della sperimentazione e quantificazione comportamentale. In tempi di imaging prolungati passati sono stati impiegati con intervalli più lunghi tra ogni immagine. La cameruna può essere impostato ad una risoluzione più bassa per l&#39;imaging a velocità il video (30 fotogrammi al secondo). Mentre la risoluzione inferiore limita le registrazioni per un unico piatto multiwell, le registrazioni video sono appropriate per l&#39;imaging rapido gare di nuoto 15. </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Le immagini devono essere aperti con ImageJ ed utilizzati con una macro che è stato scritto specificamente in-house. La macro divide automaticamente i canali di colore in modo che il colore rosso può essere rimosso, sottrae il fondo, applica una soglia, e identifica l&#39;larve mediante analisi delle particelle. La macro più attuale per cinque analisi corsia larvale è Zebrafish_macro25k. Utilizzare le istruzioni nella macro per impostare il numero di immagini, di colore da sottrarre, soglia di immagine, ecc </li><li> Dopo che tutte le immagini è gestita attraverso la macro ImageJ, verrà visualizzato un file di risultati e conterrà le coordinate x, y del larve individuale per ogni immagine con il numero dell&#39;immagine e il numero di corsia. </li&gt; <li> Il file dei risultati deve essere salvato in formato Excel e ordinati in base alla sfondo bianco vs mobile bar sfondo e poi il numero di bene. Un modello di Excel deve essere utilizzato, che ha equazioni costruite in che determina automaticamente il posizionamento di larve nei pozzi, la distanza tra le larve, velocità di movimento, e la quantità di riposo. Il modello di Excel più recente è 25ib creato nel Creton laboratorio, che è disponibile su richiesta. Grafici che mostrano i vari gruppi di trattamento dovrebbero essere integrati nel foglio Excel con t-test per il confronto tra i gruppi di trattamento e di controllo. Ulteriore analisi statistica può essere eseguita utilizzando SPSS. </li></ol>

<ol>
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M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+edge:+pharmacological+evidence+for+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).</li><li>Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+sub-chronic+exposure+to+chlorpyrifos+reduces+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Neurotoxicol. Teratol. , (2012).</li><li>Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Mentre stiamo migliorando continuamente il nostro nuovo metodo di analisi del comportamento, è sempre stato utile per la ricerca di evasione e di comportamento thigmotaxis in zebrafish larve 15. Molte prove sono state eseguite per ottimizzare i risultati del dosaggio, come il colore di stimolo utilizzato, il numero ideale di larve per corsia, e la lunghezza di dosaggio comportamentale. In precedenza, abbiamo usato piastre multi-pozzetto (con 6 o 12 pozzetti) 15,17,18. Tuttavia, di recente abbiamo creato lo stampo corsia romanzo di creare uno spazio più grande per il nuoto larve che ci permette di raccogliere un maggior numero di misure comportamentali in un singolo test 16 (Figura 5). Altre modifiche includono variazioni della PowerPoint indicato (movimento alterato o la lunghezza del test) e la dimensione delle corsie utilizzate (abbiamo anche stampi per vicoli più stretti). Attualmente, questo sistema automatizzato ad alta velocità è unico nella sua capacità di misurare una vasta gamma di comportamenti in zebrafish larve, allo stesso tempo, come la velocità, l&#39;evasione, la vicinanza alle altre larve, e thigmotaxis in piastre a più corsie. Risultati possono essere ottenuti rapidamente e un gran numero di larve possono essere analizzati al momento imaging. Il sistema è sia poco costoso da costruire e facile e veloce da installare. Un limite di questo sistema è che i movimenti 3-D non possono essere valutati in larve di zebrafish. I sistemi automatizzati che traccia zebrafish adulto hanno la capacità 3-D e in grado di identificare una gamma più ampia di comportamenti come il movimento verso l&#39;alto o verso il basso all&#39;interno della colonna d&#39;acqua 10,19. Un&#39;altra limitazione è che il nostro sistema di imaging non è attualmente ottimizzato per le analisi high-throughput a velocità video. L&#39;imaging velocità Video è possibile quando si imposta la fotocamera a una risoluzione più bassa 15, ma questo limita l&#39;analisi a un unico piatto. Nell&#39;uso del metodo appena creato &quot;corsia&quot;, più parti del saggio dovevano essere eseguite in maniera precisa. Quando si posizionano le larve in tegli corsie, è fondamentale per assicurarsi che il livello del liquido è molto bassa fino a quando le piastre sono posizionate sulla parte superiore dello schermo del computer portatile. Se le corsie sono troppo pieno di liquido, le larve fuga nella periferia della piastra. Inoltre, quando si inserisce lo stampo in agarosio, bisogna fare attenzione ad abbassare lo stampo molto lentamente. Se lo stampo viene inserito troppo in fretta, le bolle si formano in agarosio e saranno identificati dalla J macro immagine come ulteriore larve. Si consiglia che, se le corsie di agarosio sono anche un paio di bolle, è meglio farne di nuovi. In futuro, vorremmo ottimizzare la nostra analisi comportamentale per analizzare altri comportamenti complessi come l&#39;apprendimento in larve di zebrafish e di esaminare come l&#39;apprendimento possa essere influenzata dall&#39;esposizione a sostanze tossiche e farmaci in sviluppo precoce. Attualmente stiamo lavorando su saggi che possono essere utili per analizzare il comportamento di apprendimento in cui i risultati comportamentali possono facilitare determinare quali aree del cervello sonocolpiti da certe sostanze tossiche o farmaci durante lo sviluppo. Test automatici sono stati sviluppati per misurare i comportamenti in zebrafish larve di 20 e di questi test di apprendimento può essere modificabile per high-throughput screening utilizzando la risposta di evitamento robusta in piastre a più corsie. Proponiamo che questo test comportamentale potrebbe essere utilizzato in studi futuri per testare gli effetti sullo sviluppo di un gran numero di farmaci e sostanze tossiche. Tali studi potrebbero fornire una serie di informazioni sui fattori di rischio specifici e di contribuire alla definizione di orientamenti per la salute e la sicurezza migliori per le donne incinte e bambini.

Zebrafish stanno diventando un modello popolare per le scienze genetiche, sviluppo e comportamentali 1-4. Si schiudono dalle loro chorions da 2-3 giorni dopo la fecondazione (DPF), sviluppare pienamente organi funzionanti ad 4-5 dpf, e presentano un gran numero di comportamenti di 7 dpf 5,6. Zebrafish larve sono ideali per le analisi high-throughput a causa delle loro piccole dimensioni 7,8. Il software è disponibile in commercio per le analisi automatizzate di comportamento larvale e adulto zebrafish 9-14. Tuttavia, questo software può essere costoso e ha opzioni limitate per la misurazione di comportamenti complessi di larve di zebrafish in piastre multi-pozzetto. Abbiamo creato un sistema di imaging di alto-rendimento romanzo che è poco costoso da installare e in grado di quantificare una serie di comportamenti diversi in 7 dpf zebrafish larve 15,16. Il sistema consente di testare rapidamente ed efficientemente sottili anomalie del comportamento dopo l&#39;esposizione embrionale ad un numero difarmaci e sostanze tossiche ambientali 16-18. Il sistema è stato costruito utilizzando armadi in legno, che ospitano una fotocamera digitale nella parte superiore del mobile. La fotocamera rivolta verso il basso sul fondo del mobile in cui un computer portatile è collocato con lo schermo rivolto verso l&#39;alto 15. Tempo lapse imaging viene utilizzato per catturare il posizionamento delle larve nelle corsie. Le larve può essere ospitato in un massimo di quattro piastre multi-pozzetto o più corsie che sono posizionati sulla parte superiore dello schermo del computer portatile. Usiamo una presentazione di PowerPoint come stimolo negativo a cui le larve risponde allontanandosi (evitamento) e nuotando verso il bordo (thigmotaxis) 15,17. Le immagini vengono importate in ImageJ in cui una macro automatico è usato per separare i canali di colore, sottrarre lo sfondo, e applicare una soglia per identificare larve individuale. Le coordinate sono elencate per ogni larva in ogni immagine e possono essere inseriti in un file Excel che usiamo per quantificare l&#39;evasione e thigmotacomportamento xis, pesce a distanza di pesce, la velocità e la quantità di riposo 16 nuotare.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

Abbiamo creato un sistema di imaging ad alta produttività romanzo per l&#39;analisi del comportamento in 7 giorni di età larve di zebrafish in piastre a più corsie. Questo sistema misura i comportamenti spontanei e la risposta a uno stimolo avversivo, riportato alle larve attraverso una presentazione di PowerPoint. Le immagini registrate vengono analizzati con una macro ImageJ, che suddivide automaticamente i canali di colore, sottrae il fondo, e si applica una soglia di identificare il posizionamento individuale larve nelle corsie. Possiamo quindi importare le coordinate in un foglio di Excel per quantificare la velocità di nuotata, la preferenza per il bordo o lato della corsia, il comportamento riposo, thigmotaxis, distanza tra le larve, e il comportamento di evitamento. Sottili cambiamenti nel comportamento sono facilmente rilevabili con il nostro sistema, rendendolo utile per analisi comportamentali dopo l&#39;esposizione alle sostanze tossiche o prodotti farmaceutici ambientali.

Nei nostri saggi precedenti, utilizzando la sfera di rimbalzo aversive stimolo, tipo selvatico larve che vengono trattati rispondere alla palla in movimento nuotando giù nel bene (comportamento di evitamento) e verso i bordi del pozzo (comportamento thigmotaxis) 15. Abbiamo poi confermato che il comportamento thigmotaxis in questo saggio è una misura del comportamento di ansia legati in zebrafish larve 17. Vi erano differenze significative nel movimento larve lontano dalla palla e la preferenza per il bordo rispetto allo sfondo bianco vuoto. Questi comportamenti sono stati confermati nel nostro nuovo test utilizzando la barra rossa in movimento e sono ancora più robusto 16. Inoltre, si può campionare un numero maggiore di comportamenti in un singolo saggio inclusi velocità nuotata, riposo, preferenza per l&#39;estremità o lato del bene, e la distanza tra pesce (Figura 5). Larve controllo coltivato in acqua uovo mostrano un maggiore preferenza da giù nel piatto e sul bordo della corsia unopo sono presentati con uno stimolo negativo (spostamento barra rossa). Risultati simili si ottengono quando le larve sono coltivate in acqua uovo contenente 1 mg / ml di DMSO, un solvente che viene comunemente utilizzato per sciogliere i vari farmaci e sostanze tossiche come 1.000 x soluzioni stock. Risultati rappresentativi sono mostrati in figura 5 in larve trattate con acqua uovo e DMSO (come controlli) e concentrazioni variabili di un pesticida organofosfati trovano negli alimenti non biologici. I risultati mostrati sono un campionamento da un esperimento. Tuttavia, se ripetuta, i risultati indicano che la velocità di nuotata e il comportamento thigmotaxis è alterato da basse concentrazioni di pesticidi organofosfati, che imitano i livelli del consumo alimentare umano 18. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> Figura 1. Vasche di raccolta. Vetro pyrex piatti vengono utilizzati per raccogliere embryos dalle vasche dei pesci adulti. Coperchi dei piatti Pyrex sono state tagliate e inserite con griglie di plastica e filo verde è stato cucito sopra le griglie in plastica. Questo crea un ambiente fertile per la zebrafish adulto imitando l&#39;ambiente naturale. <img alt="Figura 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> Figura 2. Muffa di plastica e agarosio corsie. A) Lo stampo viene mostrato a sinistra. 0,8% agarosio viene versata in un piatto uno-bene, lo stampo viene inserito lentamente e poi rimosso quando l&#39;agarosio è raffreddato B) La piastra a destra mostra le corsie creati in agarosio dalla muffa di plastica.. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> Figura 3. Imaging Armadi armadi. Imaging erano specially costruito nel nostro laboratorio e utilizzata per analisi comportamentali high-throughput. Un megapixel fotocamera digitale 15 è stato collegato alla parte superiore del mobile rivolta verso il basso al fine di raccogliere le immagini lasso di tempo delle larve in lastre incanalatori sovrapposti dello schermo di un computer portatile. Tra le piastre e lo schermo vi è un diffusore di plastica che viene utilizzato per prevenire moiré nelle immagini raccolte. <img alt="Figura 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> Figura 4. Priorità bassa in bianco e PowerPoint aversive stimolo. Questa è la corrente di PowerPoint utilizzato per evocare cambiamenti comportamentali in larve di zebrafish. Esso fornisce robuste differenze comportamentali tra A) lo sfondo bianco e B) la barra rossa in movimento. <img alt="Figura 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> Figura 5. Comportamenti quantificati nel saggio ad alta prestazione. Esempio di comportamenti che sono quantificate dalla nostra analisi comportamentale all&#39;interno del foglio Excel che usiamo per coordinate x, y del larve. Le barre bianche indicano i dati da larve esposte a uno sfondo bianco e le barre rosse indicano i dati del larve esposte al bar in movimento rosso in PowerPoint. I grafici si riferiscono alle misurazioni che possono essere ottenuti da analisi comportamentale A) percentuale di larve giù nella corsia, B) Percentuale di larve sull&#39;estremità della corsia, C) Percentuale di larve sul bordo della corsia, D) Distanza tra pesce (mm), E) la velocità delle larve (mm / min), F) Percentuale resto del larve nuotare. Nei grafici riportati, dati va da treatmento delle larve con controllo DMSO e diverse concentrazioni di pesticida compresa tra 0,001 e 0,1 micron (livelli che si trovano comunemente nella dieta umana). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Il nostro laboratorio ha sviluppato un sistema di imaging automatizzato romanzo ad alta produttività che è utile per il rilevamento di diversi comportamenti differenti in 7 giorni di età zebrafish larve. Il sistema può essere usato per rilevare sottili cambiamenti nel comportamento dopo le larve sono stati esposti agli agenti tossici ambientali o farmaceutici.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  Brown University. Il nostro laboratorio ha sviluppato un sistema di imaging automatizzato romanzo ad alta produttività che è utile per il rilevamento di diversi comportamenti differenti in 7 giorni di età zebrafish larve. Il sistema può essere usato per rilevare sottili cambiamenti nel comportamento dopo le larve sono stati esposti agli agenti tossici ambientali o farmaceutici.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Ricerca

Neuroscienze

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Imaging e FIMtrack: due nuovi strumenti che ad alta produttività e costo effettivo Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Analisi comportamentale e fisiologica in un modello di zebrafish di epilessia

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Uso delle larve di zebrafish per studiare le conseguenze patologiche della corsa emorragica

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

Immersione alternativa nel glucosio per produrre iperglicemia prolungata in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di pesce zebra

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Autore in primo piano: Imaging in vivo dell'intero cervello di larve di pesce zebra mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...