Gli anticorpi monoclonali sono noti come anticorpi monospecifici prodotti da un singolo clone di linfociti B e dagli anticorpi monovalenti che si legano allo stesso epitopo. Recentemente, l'ELISA a base di anticorpi monoclonali è diventata la nostra piattaforma emergente per l'analisi qualitativa o quantitativa di alimenti o prodotti naturali. Questo metodo è un metodo accurato, sensibile ed efficace senza noiosi passaggi di pretrattamento.
Questo è l'essenziale per i campioni biologici e le future applicazioni cliniche. La preparazione degli mAB di TCM è un passo vitale negli studi sulle caratteristiche complesse del sistema della formula TCM. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare mAB contro i piccoli composti molecolari, tra cui la sintesi artificiale dell'antigene, l'immunizzazione del topo e la fusione cellulare.
L'hapten è collegato con la proteina portante per sintetizzare l'antigene artificiale. L'antigene artificiale e i coadiuvanti completi sono misti ed emulsionati. Il topo è stato immunizzato per iniezione sottocutanea.
Eseni la milza del topo immunizzato e fai una sospensione a cella singola. Mescolare le cellule del mieloma. Gli splenociti sono isolati e fusi con la linea cellulare del mieloma del mouse sensibile a HAT con il metodo PEG.
Selezionare una linea cellulare in grado di preparare gli anticorpi da ELISA. Gli ibridomi che secernono anticorpi monoclonali reattivi all'antigene vengono clonati. Stabilire che la linea cellulare dell'ibridoma è crioconservata.
La procedura di ossidazione del periodato è stata utilizzata per la sintesi di un coniugato BSA di narigin. In primo luogo, la narigin è stata sciolta ad una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro a 100 microlitri di soluzione di pariodato di sodio appena preparata a cinque millilitri della soluzione di narigin. Mescolare la miscela a temperatura ambiente per un'ora.
In secondo luogo, aggiungere due millilitri di proteine portanti alla miscela di reazione del periodato di sodio narigin. Regolare la miscela in soluzione di pH nove e continuare a reagire per sei-otto ore. In terzo luogo, l'antigene artificiale è stato purificato con metodo di dialisi nel PDS per tre giorni per allontanare il CBS.
Il coadiuvante completo e incompleto di Freund è stato utilizzato per l'immunizzazione del topo. Per la vaccinazione, mescolare 50 microgrammi di coniugato con un volume uguale del coadiuvante completo di Freund ed emulsionare completamente. Amministrare 100 microgrammi di questa miscela a ciascun topo BALB/c tramite iniezione subcutanea dorsale.
Fornire una vaccinazione booster tramite iniezione sottocutanea due settimane dopo con la stessa quantità di coniugato mescolato con coadiuvante incompleto. Per l'immunizzazione primaria, l'adiuvante completo e immunogeno di Freund è stato utilizzato tramite iniezione subdermica. Per l'immunizzazione booster, l'adiuvante incompleto di Freund e l'immunogeno sono stati utilizzati tramite iniezione subdermica.
Per l'immunizzazione d'impatto senza coadiuvante, solo l'immunogeno è stato utilizzato tramite iniezione subdermica o iniezione intraperineale. Le cellule dello strato di alimentazione provenivano principalmente da cellule epiteliali addominali o macrofagi. RPMI 1640 FBS e HAT sono stati utilizzati per preparare il supporto dello schermo HAT.
Il supplemento HAT è stato sciolto in mezzo RPMI da 10 millilitri, quindi aggiunto in 500 millilitri RPMI 1640 contenente il 20%FBS. E il topo ICR è stato sterilizzato dal 75% di alcol etilico per cinque minuti. Dopo aver rimosso la pelliccia dall'addome con forcep emostatiche, disinfettare l'area con il 75% di etanolo.
Tagliare la pelle esterna per esporre la cavità addominale. Iniettare tre millilitri di mezzo sterile RPMI 1640 nell'addome. Quindi massaggiare l'addome per staccare altre cellule nella soluzione.
Aspirare la sospensione cellulare fetale in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare per 10 minuti a 1.000 g, scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule fetali per ottenere la sospensione a cella singola. Dopo questa procedura, sciogliere le celle utilizzando il supporto HAT.
Contare le celle per renderle 100.000 per millilitro dai membri della cella. Trasferire le cellule in 96 piastre di coltura cellulare del pozzo. Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi, 5% di anidride carbonica.
Il topo immunizzato scelto è stato sterilizzato dal 75% di alcol etilico per cinque minuti. Aspirare RPMI 1640 medio come tampone di lavaggio. Rimuovere la pelle e il tessuto muscolare usando le forbici per esporre la milza.
Isolare accuratamente la milza dalle pinzette. Quindi lavare la milza nell'RPMI 1640. Isolare la milza e tagliarla a pezzi.
Picchia lentamente la milza. Quindi è stato trattato con un mezzo RMPI 1640 per sciogliere le cellule per preparare una sospensione cellulare di milza. Successivamente, le cellule sono state filtrate da 800 filtri cellulari mesh.
Inchiodare accuratamente la milza per rimuovere i grandi tessuti. Evitare grandi tessuti influenza la fusione delle cellule. Era la sospensione cellulare di milza con mezzo RPMI 1640.
Quindi la sospensione cellulare è stata aggiunta nel tubo di centrifuga. Raccogliere le cellule di milza per centrifugazione a 1.000g per 10 minuti. E poi scartare il supernatante.
Le cellule di milza avrebbero dovuto ammontare da un miliardo a 10 miliardi. Rimuovere le cellule di mieloma coltivate e amplificate dall'incubatrice e scuotere delicatamente il pallone per ottenere una sospensione cellulare. Era la sospensione con RPMI due volte.
Mescolare la sospensione cellulare della milza e le cellule del mieloma. Contare le cellule e regolare la concentrazione. La razione finale delle cellule di milza alle cellule del mieloma dovrebbe essere da uno a cinque a uno a 10.
Centrifugare la miscela cellulare e quindi rimuovere il supernatante. Aggiungere un millilitro di soluzione di glicole polietilene al 50% alle cellule e mescolare delicatamente a 37 gradi per un minuto. In piedi per 30 secondi, aggiungere due millilitri di mezzo RPMI 1640 e incubare a 37 gradi per due minuti per terminare la reazione.
Aggiungere in due millilitri RPMI per un altro minuto. Quindi, aggiungere in 10 millilitri RPMI 1640. Centrifuga a 800g per 10 minuti.
Scartando il supernatante, aggiungere la soluzione di HAT e continuare a coltivare le cellule per sette giorni a 37 gradi 5% di anidride carbonica. Dopo sette giorni, i supernatanti cellulari in 96 piastre di pozzo sono stati aspirati dopo la fusione cellulare e aggiunti in piastre ELISA pre-rivestite con antigene di rivestimento. Coltivato a 37 gradi per un'ora, l'anticorpo secondario è stato aggiunto e coltivato per mezz'ora.
Dopo aver aggiunto 100 microlitri di soluzione di substrato. Ferma la reazione. Per le piastre ELISA nel lettore di micropiastrine, è stato utilizzato il metodo endpoint per leggere i dati a 450 nanometri.
Assorbanza misurata a 450 nanometri e scherma gli ibridomi positivi. Utilizzare il metodo di diluizione limitante per preparare gli ibridomi monoclonali. Dopo aver rimosso il supporto HD dagli ibridomi selezionati, sospendere di nuovo le celle in RPMI 1640 e contarle.
Diluire le cellule di una concentrazione di una cellula, due cellule e quattro cellule per pozzo di RPMI 1640 in una piastra e coltura di 96 pozzi. Trasferire le cellule dagli ibridomi positivi a 24 piastre di pozzo, matavole da 25 e 75 centimetri quadrati per la coltivazione. Conservare i miodomi in una scatola di raffreddamento sfumato a meno 80 gradi per 24 ore.
Quindi trasferimento all'azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine. Il giacimento di antisiero è stato determinato dall'ELISA indiretta. Il topo da uno a quattro è stato immunizzato con coniugato BSA di narigin era significativamente più alto del topo di controllo senza immunizzarsi.
Il titer da uno a 5.000 è una diffusione sufficiente. Il peso molecolare del coniugato hapten è stato confermato dall'analisi MALDI-TOF. Come mostrato nella figura due, come è noto un peso molecolare dello standard BSA e della narigin, possiamo calcolare e determinare che le molecole di narigin sono state coniugate con BSA.
Solo l'ibridoma può sopravvivere e crescere nei supporti di selezione HAT. Dopo sette giorni di crescita, la coltura cellulare può essere testata da ELISA. Gli ibridomi positivi sono stati ri-clonati ed espansi.
Queste immagini mostrano il risultato convenzionale per linee cellulari stabili di ibridoma monoclonale e policlonale. Il punto critico di questo esperimento è lo screening degli mAb specifici per gli hapten, ma non per le proteine portanti. La specificità del mAb è stata quindi esaminata in presenza di altri composti strutturalmente correlati.
La reattività incrociata è stata calcolata per valutare la specificità mAb dell'antigene. Sono state ottenute la curva di taratura della naringina e della gamma di rivestimenti. Gli ibridomi monoclonali specifici dell'antigene sono stati ampliati e crioconservati in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.
Dopo aver visto questo video, spero che abbiate una buona comprensione di come generare anticorpi monoclonali contro un piccolo composti molecolari. Quindi questo è tutto. Grazie per la vostra visione e buona fortuna per i vostri esperimenti.
