Questo saggio collega la modulazione della struttura batterica e della funzione all'attività antibatterica basata sulle cellule immunitarie. Come tale, un'immunoterapeutica chiave di un potenziale trattamento può essere valutata nel determinare la probabilità di una migliore clearance batterica. Il saggio di uccisione opsonofagocitica serve tradizionalmente come gold standard per valutare le funzioni efficaci degli anticorpi sollevati contro il batterio come osservante.
Questo protocollo offre semplicità e versatilità rispetto ai test standardizzati ad alta produttività esistenti. In questo protocollo, studiamo gli effetti di un trattamento farmacologico sulla polmonite da streptococco e come questi effetti si traducono in una migliore fagocitosi del batterio. Qui, applichiamo l'OPKA alle cellule della polmonite dello streptococco.
Tuttavia questo protocollo può essere adottato per valutare l'uccisione fagocitica di altri agenti patogeni da parte delle cellule immunitarie. Dedicare tempo per ottimizzare le scorte batteriche e garantire che i CFC finali da contare rientrano nell'intervallo ottimale. Si consiglia vivamente di utilizzare la citometria a flusso per garantire che le cellule HL60 siano vitali e attive e provare diverse condizioni di coltura per garantire cellule funzionalmente attive.
La dimostrazione visiva fornirà una migliore comprensione di come il campione deve essere placcato e come ottenere campioni contati. Per iniziare, preparare i mezzi di coltura cellulare HL60 composti da 500 millilitri RPMI integrati con L-glutammina e 15 millilitri riscaldano il siero bovino fetale inattivato. Per la propagazione e il mantenimento di cellule HL60, coltura di cinque milioni di cellule in 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare HL60 in contenitori ventilati di 75 centimetri quadrati a 37 gradi celsius e anidride carbonica al cinque%.
Per generare scorte di lavoro di cellule HL60, aggiungere circa un milione di cellule per millilitro nei mezzi di coltura HL60 integrati con solfossido di dimetile al 10% in un tubi criogenici millilitro. Per differenziare le cellule HL60, coltura 1,5 per 10 per le sette cellule in 15 millilitri di ambienti di coltura cellulare HL60 integrati con 0,6%DMF in filtro sterile limitato 75 flaconi di centimetri quadrati a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica per tre giorni prima di OPKA. Per preparare i campioni di stock batterici, far crescere il ceppo batterico WU2 in un brodo appropriato per circa due o quattro ore a 37 gradi Celsius.
Successivamente, pelletare i batteri per centrifugazione a seimila volte G per due minuti e rimescolare le cellule in 10-30 millilitri di 15%glicerolo nel brodo appropriato. Aliquotare la coltura batterica in tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri e conservare a 80 gradi celsius. Successivamente, scongelare una fiala di stock batterico in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Pellet le cellule batteriche e resuspend in 500 microlitri di FFS in condizioni sterili. Diluizioni della piastra del calcio batterico non trattato sulle placche di agar del sangue e coltura delle piastre durante la notte a 30 gradi Celsius. Dopo la fase di incubazione, contare le colonie per ogni diluizione di stock batterico non trattato co-coltivato con cellule HL60.
Registra quale diluizione di batteri produce il numero ottimale di colonie numerabili per i futuri OPKA con questo stock batterico. Scongelare un tubo di calcio batterico. Batteri a pellet a seimila volte G per due minuti e rimosi il pellet cellulare in OBB alla diluizione ottimale ottenuta nella fase precedente.
Pipetta 10 microlitri della diluizione batterica rimostrata per pozzo in un fondo rotondo 96 piastra di coltura cellulare del pozzo. Quindi, aggiungere 20 microlitri di un anticorpo appropriato o di un trattamento farmacologico a ciascun pozzo sperimentale in duplice copia. Per i pozzi di controllo, utilizzare 1XPBS o OBB a seconda del tampone utilizzato per i pozzi di trattamento.
Agitare la piastra campione a circa 90 giri/min a temperatura ambiente per un'ora. Per raccogliere le cellule differenziate HL60 che vengono trattate con DMF tre giorni prima, pelletare le cellule a 500 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet con almeno 10 millilitri di 1XPBS.
Pellet le cellule lavate a 500 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in OBB. Aggiungere siero sterile di coniglio non diluito a un volume finale da uno a cinque.
Dopo un'ora di coltura batterica, dividere ogni campione in pozzi duplicati per due gruppi. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della miscela di complementi HL60 a ogni set sperimentale di pozzi e 50 microlitri di OBB solo ai pozzi dei batteri. Agitare la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per un'ora.
Per placcare i campioni, diluire ogni pozzo con OBB a uno o cinque volumi finali in modo che ogni campione abbia un volume di almeno 50 microlitri. Successivamente, pipetta 50 microlitri di ciascun campione direttamente su un'area designata di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra i campioni. Coprire e lasciare asciugare i campioni per circa 15 minuti a temperatura ambiente.
Invertire i piatti e la coltura durante la notte a 30 gradi celsius. In alternativa, piastre di coltura in barattoli anaerobici per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o per controllare la morfologia. Dopo la coltura notturna, contare le colonie in ogni area campione designata e procedere all'analisi dei dati confrontando il numero di cellule vive in ogni set con i controlli corrispondenti.
Gli aspetti più difficili della creazione di questa tecnica per la prima volta saranno probabilmente l'ottimizzazione dei CFC di partenza dello stock batterico, oltre a garantire che le cellule HL60 siano efficacemente differenziate. Prima di iniziare l'OPKA, la differenziazione HL60 è stata convalidata usando la citometria del flusso con ioduro di propidio come marcatore di vitalità. Dopo essere stato trattato con DMF per tre giorni, l'espressione di CD35 è stata aumentata e l'espressione di CD71 è stata ridotta.
Le percentuali medie di CFC batterici nei gruppi trattati con HL60 rispetto ai corrispondenti gruppi trattati non HL60 sono state utilizzate per confrontare la sopravvivenza cellulare batterica di diversi trattamenti. I risultati hanno mostrato che con un trattamento efficace, il numero di colonie era diverso tra la co-coltura HL60 e nessuna cellule HL60, indicativa di fagocitosi più efficiente. I risultati hanno mostrato che quando la diluizione batterica non è stata ottimizzata o la crescita della colonia non è stata osservata con attenzione dopo la placcatura, la crescita troppo delle colonie poteva impedire un conteggio accurato delle colonie.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è monitorare attentamente l'incubazione batterica in modo da evitare la crescita troppo dei CFC. I saggi in vivo possono essere utilizzati per valutare un'efficace clearance batterica all'interno di un ospite. Questi test possono essere utilizzati per confermare l'efficacia immunitaria osservata con l'OPKA sono traducibili in modelli umani o animali.
Il saggio di uccisione opsonofagocitica è stato usato con grande effetto in precedenti studi di ricerca significativi per collegare le terapie antibatteriche alle risposte immunitarie fagostiche. Lavorare con agenti patogeni batterici può essere pericoloso. Si prega di indossare dispositivi personali protettivi in ogni momento durante questo test.
