Ringraziamo RB Tesh per fornire il mouse policlonale anti-RVFV antisiero e M. Griffin del UTMB Citometria a Flusso Nucleo Struttura per un aiuto con la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da 5 U54 AI057156 attraverso l&#39;occidentale Centro Regionale di Eccellenza, NIH R01 AI08764301, e il finanziamento del Centro per lo Sviluppo Sealy Vaccino a UTMB.BK è stato sostenuto dalla James W. McLaughlin Fellowship Fund presso UTMB.OL è stato sostenuto da un Maurice R. Hilleman fase iniziale di carriera Career Investigator Award.

Analisi della trascrizione mediante microscopia a fluorescenza 1. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE <ol><li> Luogo di 12 mm coprioggetto rotondi in 12 pozzetti coltura tissutale, un coprioggetto per pozzetto. </li></ol> Nota: se le cellule hanno difficoltà aderendo al coprioggetto, cappotto con poli-L-lisina (MW ≥ 70.000) prima di mettere in pozzi. A tale scopo, coprioggetto sommergere in una soluzione sterile 0,1 mg / ml in H 2 O di poli-L-lisina per 5 min. Risciacquare con coprioggetto sterili H 2 O e asciugare per almeno 2 ore. <ol start="2"><li> A seme 293 cellule su vetrini coprioggetto, aggiungere 5 x 10 4 cellule in 1 ml di mezzo di crescita (DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina) per pozzetto. Incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 O / N. </li><li> Infettare cellule con MP-12 in una molteplicità di infezione (moi) di 3. Includere almeno due<html> pozzi infetti: uno dei due pozzi servirà come il controllo non infetto, l&#39;altra saranno trattati con actinomicina D (ACTD) al punto 1.5 come controllo per la repressione trascrizionale. Rimuovere mezzo di crescita e diluire il magazzino virus in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto è 200 ml. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Nota: Invece di infettare le cellule, le cellule possono essere trasfettate con DNA plasmidico o sintetizzati in vitro di RNA codificante per una proteina virale specifico. A questo scopo, trasfettare cellule con un appropriato reagente di trasfezione chimica secondo le istruzioni del fabbricante e procedere al punto 1.5 a 16 ore dopo la trasfezione. Si consiglia di ottimizzare le condizioni di trasfezione e il tempo di incubazione prima dell&#39;etichettatura RNA e fissazione. <ol start="4"><li> Rimuovere inoculo e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 15 ore. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Nota: Se adattare questo protocollo per l&#39;uso con un altro virus, si consiglia di eseguire un esperimento corso del tempo per determinare il punto di tempo ottimale per l&#39;etichettatura di RNA e la fissazione Impostare questa volta ovviamente in modo che i tempi di infezione sono sfalsati e tutti campioni possono essere etichettati, fissate e colorate allo stesso tempo. <ol start="5"><li> A 15 ore dopo l&#39;infezione (HPI), sostituire il terreno di coltura con terreno contenente 1 mM UE. Per uno dei pozzi infetti finti, aggiungere anche 5 mcg / ml ACTD. Questo servirà come controllo per la repressione trascrizionale, come ACTD inibisce la sintesi di RNA DNA-dipendente. Cellule Rientro in incubatrice. </li><li> Al 16 HPI, rimuovere il terreno e lavare i coprioggetti una volta con 1 ml di PBS (KCl 0,20 g / l, KH 2 PO 4 0.20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1.15 g / L, pH 7,4) per pozzetto. Fix cellule aggiungendo 1 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT. </li></ol>Nota: Per preparare la soluzione di fissaggio 4% PFA, sciogliere 10 g di paraformaldeide in 150 ml di H 2 O riscaldata a 60 ° C su un agitatore magnetico riscaldato. Aggiungere 500 ml di NaOH 1M e continuare a mescolare fino a quando la soluzione diventa chiara. Filtro soluzione PFA attraverso una carta da filtro per rimuovere le particelle e aggiungere 62,5 ml di tampone fosfato (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7.4). Aggiungere H 2 O fino ad un volume totale di 250 ml. Congelare a -20 ° C in aliquote monouso. <ol start="7"><li> Lavare una volta con 1 ml di PBS per pozzetto. Non è richiesto alcun tempo di incubazione per questa e tutte le successive fasi di lavaggio. Procedere immediatamente alla fase 2. </li></ol> Nota: è importante procedere immediatamente con la reazione scatto, come l&#39;RNA degenera se conservate a questo stadio per periodi di tempo prolungati, una perdita del segnale di fluorescenza RNA è già emersa se ​​le cellule sono conservate per 1 ora a 4 ° C . Allo stesso modo, se performando un esperimento corso di tempo, essere sicuri di etichetta, correggere e macchia tutti i campioni contemporaneamente. 2. Clicca Reazione a rilevare RNA marcate <ol><li> Permeabilize cellule aggiungendo 1 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubare per 10 min a RT. </li></ol> Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in passaggi da 2.1 a 2.3 devono essere nucleasi libero. <ol start="2"><li> Lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Togliere i coprioggetti da 12-pozzetti e trasferimento in camera umida. Coprire ogni vetrino con 50-100 soluzione colorante click microlitri (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 20 mM azide fluorescente [eccitazione / emissione massima: 590/617 nm], 100 mM di acido ascorbico) ciascuna. Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Per assemblare la camera umida, linea di fondo di una coltura cellulare o capsula di Petri con un diametro di 10 cm con una pellicola di plastica paraffina. Rivestire l&#39;interno del bordo del dish con tovaglioli di carta umidi. Posizionare il coprioggetto sulla pellicola di plastica paraffina. Nota: Fare attenzione a non lasciare che i coprioggetti asciugare nel corso di questo o di qualsiasi altro passo nel protocollo. È consigliabile aggiungere la soluzione di colorazione per ciascun coprioggetto direttamente dopo che è stato collocato nella camera umida. Nota: Preparare la soluzione colorante click fresco immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di 1,5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO 4, e 500 mM di acido ascorbico possono essere conservati a 4 ° C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione madre di acido ascorbico che ha trasformato giallo. Nota: Assicurarsi di selezionare un fluoroforo che corrisponde ai filtri il microscopio a fluorescenza. <ol start="4"><li> Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto in un fresco 12-pozzetti e lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li></ol> Nota: se non deprotezione di proteine ​​virali è desiderato, coprioggetto può essere montato e ripreso dopo questo passaggio (passare al punto 3.3). 3. Immunofluorescenza per rilevare l&#39;espressione di proteine ​​virali <ol><li> Aggiungere 1 ml di tampone di bloccaggio (3% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) in PBS) a ciascun pozzetto ed incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Togliere i coprioggetti da 12-pozzetti, trasferimento in camera umida e coprire con 50-100 ml di anticorpo primario (anti-RVFV, un gentile dono del Dr. RB Tesh, UTMB) diluito in tampone di bloccaggio (1:500). Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Quando adattare questo protocollo per l&#39;utilizzo con un virus diverso, determinare la diluizione ottimale per il primo anticorpo primario. Nota: In alternativa, questa fase può essere realizzata O / N a 4 ° C al buio. <ol start="3"><li> Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto di nuovo in 12-pozzetti e lavaretre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Rimuovere coprioggetto da posto 12-bene, posto in camera umida e coprire con 50-100 ml di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [eccitazione / emissione massima: 495/519 nm]) diluito in tampone di bloccaggio (1: 500). Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Assicurarsi di selezionare un anticorpo secondario in grado di riconoscere il vostro anticorpo primario e corrisponde ai filtri il microscopio a fluorescenza. Nota: Se si desidera, 200 ng / ml DAPI può essere aggiunto alla diluizione anticorpo secondario per visualizzarne nuclei. <ol start="5"><li> Rimuovere coprioggetto dalla camera umida e posto di nuovo in 12-pozzetti e lavare tre volte con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Montare coprioggetto mettendo una goccia (ca. 15 ml) di Fluoromount-G su un vetrino da microscopio. Immergere il vetrino in H 2 O, eliminare l&#39;eccesso di H 2 O toccando thlato e contro un tovagliolo di carta, e posto cellula-lato giù nella goccia di Fluoromount-G. Aria secca per 5 min. </li></ol> Nota: Se l&#39;imaging su un microscopio invertito, consentire Fluoromount-G a solidificare a 4 ° CO / N o apporre il coprioggetto al vetrino sigillando il bordo con smalto trasparente. Nota: Le diapositive possono essere ripreso immediatamente o conservati a 4 ° C al buio per un massimo di una settimana. 4. Acquisizione di dati <ol><li> Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol> Nota: Assicurarsi di selezionare fluorofori adeguati che possono essere visualizzati utilizzando il microscopio. Per riferimento, i seguenti sono i fluorofori e set di filtri utilizzati per acquisire le immagini mostrate in questa pubblicazione. DAPI: Filtro di eccitazione: BP 330-385 Specchio Dichromatic: 400 DM Filtro per le emissioni: LP 420 Filtro di eccitazione: BP 460-490 Specchio Dichromatic: 505 DM Filtro per le emissioni: LP 510 Fluoroforo con eccitazione / emissione massima di 590/617: Filtro di eccitazione: BP 545-580 Specchio Dichromatic: 600 DM Filtro per le emissioni: LP 610 Analisi della trascrizione mediante citometria di flusso 5. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE <ol><li> Seme 293 cellule in 6 pozzetti coltura tissutale nel terreno di coltura (DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina). Incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 finché le cellule hanno raggiunto 80 - 100% di confluenza. </li><li> Infettare cellule con MP-12 ad una MOI di 3. Includere almeno due pozzi infetti: uno dei due pozzi servirà come il controllo non infetto, l&#39;altra saranno trattati con ACTD a passo5.4. Rimuovere mezzo di crescita e diluire il magazzino virus in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto è di 400 microlitri. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Rimuovere inoculo e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 12 hr. </li></ol> Nota: Se adattare questo protocollo per l&#39;uso con un altro virus, si consiglia di eseguire un esperimento corso del tempo per determinare il punto di tempo ottimale per l&#39;etichettatura e la raccolta. Impostare questo tempo corso in modo che i tempi di infezione sono sfalsati e tutti i campioni possono essere etichettati, raccolto, e colorate allo stesso tempo. <ol start="4"><li> Al 12 hpi, sostituire terreno di crescita con terreno contenente 0,5 mM UE. Per uno dei pozzi infetti finti, aggiungere anche 5 mcg / ml ACTD. Questo servirà come controllo per la repressione trascrizionale, come ACTD inibisce la sintesi di RNA DNA-dipendente. Cellule Rientro in incubatrice. </li><li> Al 13 hpi, lavare le cellule una volta with PBS e raccolto da tripsinizzazione delle cellule. Lavare le cellule raccolte tre volte con PBS contenente 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Nota: durante questo e nei successivi passaggi, non centrifugare le cellule più veloce di 500 - 1.000 xg per evitare la rottura delle cellule. Centrifugare le cellule per 1 - 2 minuti per sedimento. Nota: Se un immunoistochimica superficie è prevista a seguito della reazione di click, raccolto utilizzando un poliziotto in gomma o un raschietto cellulare usa e getta, invece. <ol start="6"><li> Fissare le cellule da essi risospendere in 1 ml di PFA 4% e incubare per 30 minuti a RT. Fare riferimento al punto 1.6 per le istruzioni su come preparare 4% PFA. </li><li> Lavare una volta con 1 ml di PBS-EDTA per pozzetto. Procedere immediatamente alla fase 6. </li></ol> Nota: è importante procedere immediatamente con la reazione scatto, come l&#39;RNA degenera se conservate a questo stadio per periodi di tempo prolungati. Analogamente, se l&#39;esecuzione di un tempo cesperimento ourse, assicurati di etichettare, fissare e colorare tutti i campioni contemporaneamente. 6. Clicca Reazione a rilevare RNA marcate <ol><li> Permeabilize risospendendo cellule in 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubare per 10 min a RT. </li></ol> Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in passaggi 6,1-6,3 devono essere nucleasi libero. Nota: Se le cellule non sedimenti correttamente durante questa fase, aumentare il tempo di centrifugazione per 5 min. Comportamento di sedimentazione migliorerà una volta le cellule sono sospese in FACS tampone (passo 6.4). <ol start="2"><li> Lavare una volta con 1 ml di PBS. </li></ol> Nota: non utilizzare EDTA in questo passaggio come questo chelare il Cu 2 + ioni necessari per la reazione click. <ol start="3"><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri soluzione colorante click (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 200Nm azide marcato con colorante fluorescente [excitation / emissione massima: 650/665 nm], 100 mM di acido ascorbico). Incubare per 1 ora a RT al buio. </li></ol> Nota: Preparare la soluzione colorante click fresco immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di 1,5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO 4, e 500 mM di acido ascorbico possono essere conservati a 4 ° C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione madre di acido ascorbico che ha trasformato giallo. Nota: se le cellule si aggregano assieme durante questa fase, risospendere pipettando su e giù parecchie volte. Nota: Assicurarsi di selezionare un fluoroforo che può essere rilevato dal citofluorimetro. Nota: preparare anche un campione di cellule infette che non sono soggette alla procedura di colorazione click, che saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Usare sia la metà delle cellule infette o includere un ulteriore infettato ben al passo 5.2. Questi concellule trollo saranno immunomacchiate al passo 7.1. <ol start="4"><li> Lavare due volte con tampone FACS (PBS contenente 1 mM EDTA e 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Nota: Se non si desidera immunoistochimica di proteine ​​virali, le cellule possono essere analizzati immediatamente (passare al punto 8). 7. Immunofluorescenza per rilevare l&#39;espressione di proteine ​​virali <ol><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di anticorpo primario (anti-RVFV) diluite in FACS tampone (1:10.000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li></ol> Nota: In alternativa, questa fase può essere realizzata O / N a 4 ° C al buio. Nota: preparare anche un campione di cellule non infette, che sono stati sottoposti alla procedura di colorazione click ma non verrà immunomacchiate, questi saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Usare sia la metà delle cellule infette finti o includono una ben infetto supplementare apunto 5.2. Nota: Quando adattare questo protocollo per l&#39;utilizzo con un virus diverso, determinare la diluizione ottimale per il primo anticorpo primario. <ol start="2"><li> Lavare le cellule due volte in tampone FACS. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [eccitazione / emissione massima: 495/519 nm]) diluito in tampone FACS (1:1000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule una volta in tampone FACS. </li></ol> Nota: A questo punto, le cellule possono essere conservate O / N a 4 ° C al buio. 8. Acquisizione di dati <ol><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer FACS, trasferimento in 5 ml provette di polistirene e analizzare utilizzando un citofluorimetro. Utilizzare MP-12 cellule infette (nessuno scatto di reazione, solo colorazione anti-RVFV) e le cellule infette finte (clicca unica reazione) per calibrare lo strumento. </li></ol> None: Assicurarsi di selezionare fluorofori adeguati che possono essere rilevati dallo strumento. Per riferimento, le seguenti sono le linee laser e set di filtri usati per acquisire i dati riportati in questa pubblicazione. Fluoroforo con eccitazione / emissione spettro di 495/519: Laser: 488 nm Filtro: 530/30 Fluoroforo con eccitazione / emissione spettro di 650/665: Laser: 640 nm Filtro: 670/20

<ol>
	<li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus.">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li><li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies.">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(i)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62.">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li><li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li><li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation.">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730 (2012).</li><li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus.">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).</li><li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase.">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).</li><li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TFIIH+transcription+factor,+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus.">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li><li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development.">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li><li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA,+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene,+and+expression+of+a+foreign+gene.">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li><li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH).">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002 (2012).</li><li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+and+nucleic+acid+function.">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li><li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies.">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo fornito descrive un metodo per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla trascrizione cellula ospite mediante incorporazione della uridina analogico UE in RNA nascenti. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi precedenti: è veloce, sensibile, e non si basa sull&#39;impiego di isotopi radioattivi. Inoltre, il metodo può essere adattato per produrre dati qualitativi tramite microscopia a fluorescenza o dati quantitativi tramite citometria a flusso utilizzando essenzialmente gli ste...

<html> Tradizionalmente, l&#39;attività trascrizionale è stata misurata attraverso l&#39;inserimento di una radioattivo (3 H-uridina) 1 o alogenati (BRU) 2 nucleosidi in RNA nascenti. Questi analoghi uridina vengono assorbiti dalle cellule, convertiti in uridina-trifosfato (UTP) attraverso la via di recupero nucleoside, e successivamente incorporate nella nuova sintesi dell&#39;RNA. 3 H-uridina possono essere rilevati mediante autoradiografia, che può richiedere molto tempo, o scintillazione conteggio, che richiede attrezzature specializzate. Inoltre, l&#39;uso di isotopi radioattivi non può essere pratico in una serie di impostazioni di laboratorio, compresa alto contenimento laboratori di biosicurezza. Bru può essere rilevato attraverso immunoistochimica con anticorpi anti-BRU, che possono richiedere dura permeabilizzazione per garantire l&#39;accesso degli anticorpi al nucleo o parziale denaturazione di RNA, come struttura secondaria dell&#39;RNA potrebbe essere un impedimento sterico il legame degli anticorpi. _content &quot;&gt; Il protocollo qui descritto utilizza la chimica Clicca recentemente sviluppato clicca chimica 3 per misurare l&#39;attività trascrizionale in cellule infettate con il ceppo RVFV MP-12. basa su un rame altamente selettivo ed efficace (I)-catalizzata reazione di cicloaddizione tra un alchino e una porzione azide 4,5. In questo protocollo, nascenti RNA nelle cellule infettate viene prima etichettato mediante incorporazione della uridina analogico UE. In una seconda fase, l&#39;UE incorporato viene rilevato mediante reazione con un azide fluorescente. I principali vantaggi di questo metodo sono (1) che non richiede l&#39;uso di isotopi radioattivi e (2) che non richiede aspro permeabilizzazione o denaturazione di RNA. Con un peso molecolare inferiore a 50 Da, accesso del azide fluorescente non impedito da insufficiente permeabilizzazione o RNA struttura secondaria. Inoltre, i ricercatori non sono limitati nella loro scelta di anticorpi primari quando si associa la rilevazione di RNA con una classeimmunoistochimica iCal per le proteine ​​virali. Due diversi metodi sono descritti in questo protocollo: uno per la visualizzazione di trascrizione mediante microscopia a fluorescenza (punti 1-4), e uno per quantificare la trascrizione attraverso citometria a flusso (passi 5-8). Entrambi questi metodi si combinano etichettatura di RNA nascenti con una immunocolorazione intracellulare di proteine ​​virali, che consente una correlazione tra l&#39;attività trascrizionale e l&#39;infezione virale su base cella per cella. Gli autori hanno utilizzato con successo il protocollo qui descritto per determinare l&#39;attività trascrizionale in cellule infettate con il ceppo RVFV MP-12 6 cellule infettate con differenti MP-12 mutanti 7,8, 9 e cellule infettate con virus Toscana (TOSV) 10. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per l&#39;uso con diversi virus ed ha il potenziale di essere modificato per includere immunofluorescenza di proteine ​​virali o cellulari specifici.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

Molti virus a RNA sono evoluti la capacità di inibire la trascrizione cellula ospite come mezzo per aggirare difese cellulari. Per lo studio di questi virus, è quindi importante avere un modo rapido e affidabile di misurazione dell&#39;attività trascrizionale nelle cellule infette. Tradizionalmente, la trascrizione è stata misurata mediante incorporazione di nucleotidi radioattivi come 3 H-uridina seguita da rilevamento mediante autoradiografia o conteggio a scintillazione, o incorporazione di uridina analoghi alogenati come il 5-bromouridine (BRU), seguita da rilevamento mediante immunoistochimica. L&#39;uso di isotopi radioattivi, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e non è praticabile in una serie di impostazioni di laboratorio, mentre il rilevamento di Bru può essere ingombrante e può soffrire di bassa sensibilità. La chimica click recentemente sviluppato, che comporta una formazione triazolo rame-catalizzata da una azide e un alchino, fornisce ora una rapida e highly alternativa sensibili a questi due metodi. Clicca chimica è un processo in due fasi, in cui l&#39;RNA nascente è prima etichettato per incorporazione di uridina analogico 5 ethynyluridine (UE), seguita dalla rilevazione del marchio con una azide fluorescente. Questi azidi sono disponibili come diversi fluorofori differenti, permettendo una vasta gamma di opzioni per la visualizzazione. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la soppressione trascrizionale in cellule infettate con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12 utilizzando clic chimica. Contemporaneamente, espressione di proteine ​​virali in queste cellule è determinata dalla classica immunocolorazione intracellulare. Passaggi da 1 a 4 dettaglio un metodo per visualizzare la soppressione trascrizionale tramite microscopia a fluorescenza, mentre i passaggi da 5 a 8 dettaglio un metodo per quantificare la soppressione trascrizionale tramite citometria a flusso. Questo protocollo è facilmente adattabile per l&#39;uso con altri virus.

La proteina di NSS RVFV (famiglia Bunyaviridae, genere Phlebovirus) 11 inibisce la cellula ospite trascrizione generale attraverso due meccanismi distinti: (i) sequestrando la subunità p44 del fattore di trascrizione basale TFIIH 11 e (ii), promuovendo la degradazione proteasoma della p62 subunità di TFIIH 6. Il RVFV MP-12 vaccino ceppo 13 è stato utilizzato per gli esperimenti descritti in questo protocollo da MP-12 ceppo può essere gestita in un livello...

Watch this Scientific Journal Video about Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis at JoVE.com

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Questo metodo descrive l&#39;uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l&#39;infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l&#39;uso con altri virus.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Views.  University of Texas Medical Branch. Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.

Video: Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

L&#39;effetto sinergico di luce visibile e Gentamicina su<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microrganismi

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...