Questo metodo consente di misurare la distribuzione temporale spaziale delle forze applicate dalle cellule B alla sinapsi immunitaria e correlarle con il reclutamento di proteine specifiche. La microscopia a forza di trazione con gel di poliacrilammide è facile da implementare. Questo protocollo può essere utilizzato per impostare rapidamente la misurazione delle capacità meccaniche di molte celle B.
Questo metodo è flessibile e può essere adattato al grafico di altri ligandi come le integrine o per studiare altri tipi di sinapsi immunitarie come le cellule T o la fagocitosi frustrata. A causa delle proprietà fisiche e chimiche dei gel richiesti da questo esperimento, l'adattamento dei metodi classici di microscopia della forza di trazione alle cellule B può essere complicato. Inizia salinizzando il supporto del gel.
Attivare la piastra di Petri con fondo di coverlip o vetro con una lampada UV per due minuti, quindi salinizzare con 200 microlitri di APTMS per cinque minuti. Questo preparerà il supporto per il legame covalente del gel. Lavare accuratamente il coperchio o il piatto inferiore in vetro con acqua ultra pura e asciugarlo utilizzando l'aspirazione sottovuoto.
Per preparare le coverlips per appiattire il gel, metterle in un portapazzole in ceramica, mettere il supporto in un piccolo becher e versare un reagente siliconizzante sui copripavimenti assicurandosi di coprirli completamente. Coprire il becher con un foglio di alluminio e lasciarlo a temperatura ambiente per tre minuti. Nel frattempo, riempi un grande becher con acqua ultra pura.
Dopo tre minuti di incubazione nel reagente siliconizzante, trasferire il portapazzole con le coverlips al becher con acqua. Risciacquare accuratamente i copriparsi con acqua ultra pura. Asciugarli bene e metterli su salviette di carta.
Per ottenere i migliori risultati, procedere immediatamente con la polimerizzazione del gel. Preparare un pre-mix di gel Pascal 500 secondo le indicazioni manoscritte, quindi combinare 167 microlitri del pre-mix con 1,67 microlitri di perline. Vortice e sonicare la miscela in un sonicatore da bagno per cinque minuti.
Proteggere il mix dalla luce con un foglio di alluminio. Per capitalizzare la polimerizzazione, aggiungere 1,67 microlitri di persolfuro di ammonio al mix di gel, quindi avviare la polimerizzazione aggiungendo 0,2 microlitri di TEMED e mescolando il gel con una pipetta. Per lanciare il gel, pipettare nove microlitri di gel mescolare su ogni coverlip salinizzato o piatto inferiore in vetro.
Appiattire immediatamente il gel con il coverslip siliconizzato, premendolo su di esso con le forcep per assicurarsi che il gel si diffonda su tutta l'area del coverslip e che parte di esso fuoriesi. Inverti la coverlip o la piastra inferiore in vetro in una grande piastra di Petri e toccala sulla panca per forzare le perline verso la superficie del gel. Posizionare un tessuto umidificato sul piatto per creare una camera bagnata.
Coprirlo con un foglio di alluminio e incubarlo per un'ora. Dopo l'incubazione, facilitare il rilascio di coverlip aggiungendo PBS al campione. Rimuovere con cura il coverslip con un ago, inclinando leggermente il piatto ma assicurandosi che il gel sia immerso nel PBS.
L'agente siliconizzante, l'acrilammide, l'acrilammide di base e il TEMED possono essere tossici per inalazione. Indossare dispositivi di protezione individuale standard e manipolare questi prodotti sotto una cappa chimica. Aspirare il PBS dai gel e aggiungere 150 microlitri di Sulfo-SANPAH a temperatura ambiente.
Esporre il gel al trattamento UV per due minuti, quindi lavare il gel tre volte con PBS. Ripetere il trattamento con Sulfo-SANPAH e i lavaggi PBS, quindi aggiungere 250 microlitri di lisozima all'uovo di gallina o HEL al gel e incubarlo durante la notte in una camera di umidità a quattro gradi Celsius ricoperti di foglio di alluminio. Dopo l'incubazione, rimuovere l'antigene HEL e lavare il gel con PBS tre volte.
Infine, coprire il gel con 500 microlitri di mezzi di coltura cellulare B e lasciarlo a temperatura ambiente. Utilizzare un microscopio confocale con controllo termico e dell'anidride carbonica per l'imaging. Aspirare il supporto dal gel, lasciando circa 200 microlitri.
Posizionare il gel al microscopio. Due strati principali di perline appariranno sul fondo e sulla parte superiore del gel. Concentrati sul piano del gel e trova un'area uniforme da immaginere.
Scegli attentamente l'area di imaging e assicurati di rimanere a fuoco. Un'adeguata densità di perline e una superficie uniforme sono fondamentali per ottenere misurazioni della forza robuste e affidabili. Aggiungere 80 microlitri di linfociti B primari dai topi MD4 al gel, evitando di toccare il gel per mantenere la messa a fuoco.
Assicurarsi che lo stato attivo sia ancora corretto e che le celle possano essere viste scendere nell'area. Avviare l'acquisizione prima che le cellule raggiungano il gel. Aprire il filmato come pila di immagini in ImageJ, quindi eseguire la macro cropandsave.ijm.
Scegliere una directory di output e configurare le impostazioni del canale degli attributi. Selezionare le aree di interesse con lo strumento rettangolo e aggiungerle all'elenco del ROI utilizzando il tasto T. Al termine, fare clic su OK. Quando la macro propone una maschera della cella, fare clic su OK se è soddisfacente.
Se non è soddisfacente, fare clic su NON OK e quindi selezionare manualmente un'area chiusa con qualsiasi strumento di selezione, quindi fare clic su Continua. Aprire MATLAB ed eseguire tfmv1.m. Inserire i parametri richiesti.
In particolare, controllare le proprietà dell'immagine, ad esempio le dimensioni dei pixel e l'intervallo di tempo di acquisizione e le proprietà gel come il rapporto Giovani modulo E e Poisson. Al termine, individuare gli output del software nella stessa directory del file originale. Le immagini corrette delle perline sembrano una distribuzione uniforme e casuale di punti luminosi simili a un cielo stellato.
I dati e l'analisi non sono affidabili quando il numero di perline è troppo basso o l'immagine è fuori fuoco. È possibile osservare il movimento delle perline per occhio utilizzando un telaio di riferimento che ha preceduto il primo contatto della cellula con il substrato. Risultati approssimativi potrebbero essere ottenuti dal tracciamento di singole particelle.
L'analisi fornisce una segmentazione delle perline nell'immagine di riferimento come controllo. Utilizzando il software, è anche possibile ottenere il campo di spostamento e sollecitazione, che è il vettore dello stress locale ad ogni pixel e ogni punto di tempo. Il prodotto scalare dei campi di spostamento e forza integrati sull'area della cellula fornisce il lavoro totale esercitato dalla cellula sul substrato.
Quando si confrontano due condizioni biologiche, è possibile calcolare una curva media o un valore medio negli ultimi punti di tempo in cui l'energia raggiunge un altopiano. Quando l'informazione spaziale delle forze è rilevante, è anche possibile confrontare singoli punti di tempo di ogni condizione. Un esempio di tempo di estrazione dell'antigene a fluorescenza è mostrato qui.
L'aspetto progressivo dei segnali fluorescenti alla sinapsi indica il distacco dell'antigene dal gel. I dati della fluorescenza possono essere utilizzati per costruire una curva di estrazione media. Il passaggio più delicato del protocollo è la polimerizzazione del gel sotto il coverslip.
Questo passaggio deve essere eseguito in modo relativamente rapido e attento assicurando che il gel venga spremuto uniformemente sotto il coverslip. Seguendo questa procedura, la proteina fluorescente che esprime linfociti B può essere utilizzata per valutare contemporaneamente la localizzazione delle strutture intracellulari e il patterning della forza. Questa tecnica può essere combinata con perturbazioni genetiche o chimiche per valutare il ruolo di proteine specifiche sulla contrattilità cellulare e sull'assorbimento dell'antigene.
