La microscopia a forza di trazione viene utilizzata per misurare le forze generate dalle cellule. Questo protocollo semplifica l'analisi di raccolta dei dati della forza di trazione, al fine di renderli più accessibili agli utenti inesperti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle piattaforme di microscopia a forza di trazione senza riferimenti esistenti, è che la litografia multifotona consente una riprogettazione rapida e semplice dell'impostazione del patterning in base alle singole esigenze sperimentali.
Ci sono molti passaggi chiave nella fabbricazione e nell'implementazione di questa nuova piattaforma di trazione senza riferimenti che sono più facili da capire attraverso la rappresentazione visiva piuttosto che il solo testo. Per la fotopolimerizzazione dell'idrogel di base, aggiungere prima tre microlitri della soluzione prepoli polimerica su un foglio sottile e piatto di alcani perfluoroalossici e posizionare strisce PDMS piatte spesse 150 micrometri che circondano, ma non a contatto con, la goccia di soluzione pre-polimerica. Posizionare un coverslip silanizzato acrilato sul PDMS, con la goccia pre-polimerica centrata sotto la coverslip per appiattire la goccia pre-polimerica allo spessore dei distanziati PDMS.
Esporre la soluzione pre-polimerica sandwich alla luce UV per circa un minuto. Quando un idrogel è completamente formato, separare accuratamente il coverslip dai distanziati PDMS. Utilizzare un adesivo acrilico a doppia parte ad alte prestazioni per attaccare una piastra di Petri a fondo aperto al coperchio.
Prestare particolare attenzione quando si aderisce il coverslip carico di idrogel alla piastra di Petri. Un piatto bagnato o una pressione troppo bassa durante l'applicazione consentiranno la forma di perdite, rovinando il campione. Applicare pressione sulla superficie di contatto adesiva per creare una tenuta completa tra la coverlip, l'adesivo e la piastra di Petri, facendo attenzione a non rompere il vetro.
Utilizzare PBS filtrato sterile per risciacquare l'idrogel. Quindi aggiungere otto microlitri di NVP a 800 microlitri della soluzione di laboratorio preparata per la sintesi dell'idrogel. Per convertire un'immagine binaria in una maschera digitale, aprite MATLAB e aprite ed eseguite runscript.
m Script MATLAB. Selezionare il file TIF binario per la conversione e selezionare una cartella per salvare i file dell'area. Immettere la dimensione finale desiderata nei micron dell'immagine selezionata.
L'immagine di input verrà ridimensionata e quotata in modo che corrisponda a questi parametri. Per creare un singolo array di pixel, nelle opzioni generatore area di interesse deselezionare la casella Rimuovi tic in Piccole regioni/singoli pixel, selezionare la casella Quadrati e deselezionare Usa in Linee di interruzione orizzontali. Quindi, fare clic su OK. Il file OVL si trova nella cartella specificata in precedenza.
Aprire il file nel software al microscopio e caricare le regioni desiderate che controllavano l'otturatore laser durante la litografia a scansione laser a due fotoni. I seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni con una luce minima. Per la fabbricazione di array di marcatori fiduciari in condizioni di scarsa illuminazione, mescolare accuratamente 200 microlitri della soluzione di laboratorio NVP precedentemente preparata con 20 milligrammi di Alexa Fluor 633 e rimuovere tutto il PBS dal piatto contenente l'idrogel.
Aggiungere la miscela PEG-633 all'idrogel come goccia che comprende completamente l'idrogel di base e caricare la piastra di Petri sul supporto del campione dello stadio del microscopio. Quindi coprire il piatto e lasciare che la soluzione di modelliatura si immergi nell'idrogel per almeno 30 minuti, protetta dalla luce. Per configurare il microscopio per l'imaging, selezionare i laser e i filtri appropriati per visualizzare Alexa Fluor 488.
Individuare l'idrogel utilizzando il segnale PEG-488 e bloccare la raccolta di lunghezze d'onda di emissione più lunghe dal rivelatore. Utilizzare scansioni verticali e orizzontali delle piastrelle per individuare il centro dell'idrogel nel piano XY e azzerare lo stadio in questa posizione. Utilizzare le scansioni di linea nella funzione Z-stack per individuare la superficie dell'idrogel e azzerare la messa a fuoco in questa posizione.
Livellare l'idrogel ripetendo le scansioni di linea lontano dal centro XY per identificare la posizione della superficie, regolando le viti impostate per lo stadio del microscopio, se necessario. All'interno dell'area di lavoro software del microscopio, creare un file di esperimento separato per la fotopatterning e impostare la potenza multi-fotone sull'1,8% e la velocità di scansione su sei. Regola le dimensioni del fotogramma dell'immagine e dei pixel per ottenere una dimensione in pixel di 0,1 micrometri per pixel e proporzioni da 100 a uno e carica il file delle aree nella scheda dell'area.
Utilizzare una macro per impostare tutte le aree per acquisire e attivare la funzione Z-stack. Impostare la spaziatura su 3,5 micrometri per una profondità totale di 28 micrometri e un numero totale di fette Z di nove. Quindi utilizzare la funzione Posizioni per impostare posizioni specifiche sull'idrogel in cui verranno fotopatterned gli array di marcatori fiduciari.
Man mano che il tempo di immersione si avvicina al segno di 30 minuti, acquisire successive scansioni della linea Z-stack della superficie dell'idrogel ogni cinque minuti per verificare la presenza di gonfiore in base ai cambiamenti nella posizione della superficie rispetto alla posizione di messa a fuoco azzerato. Se non si è verificato alcun cambiamento nella posizione della superficie nell'intervallo di cinque minuti, eseguire le impostazioni di patterning e utilizzare il laser a 488 nanometri per verificare che la superficie dell'idrogel non si sia mossa durante la creazione della serie. Quindi rimuovere l'idrogel dal microscopio, aspirare la soluzione PEG-633 dalla piastra di Petri e sciacquare la piastra con PBS filtrato sterile.
Per acquisire una cella e immagini di marcatori fiduciari, riportare la piastra di Petri al portacampioni per individuare le aree modellate. Individuare una cella di interesse e acquisire un'immagine trasmessa o fluorescente della cella. Quindi acquisire una pila Z dell'array modellato sotto la cella come dimostrato, e acquisire un secondo set di immagini trasmesse o fluorescenti della cella.
Quando si raccoglie uno stack di immagini, le immagini risultanti devono visualizzare una serie regolare di feature con motivi che oscillano in intensità in funzione della posizione Z all'interno dello stack di immagini. Il tracciamento. m script fornisce diverse immagini diagnostiche, tra cui una proiezione Z dei marcatori fiduciari fluorescenti per valutare la qualità di pre-elaborazione, un grafico dei centroidi rilevati, codificato a colori in funzione della posizione Z per valutare la qualità di rilevamento degli oggetti e un grafico delle tracce che rappresentano i baricentri marcatori rilevati che sono stati collegati in colonne nella direzione Z per valutare la qualità di tracciamento degli oggetti.
Lo script DISP 3D.m fornisce un grafico di intensità in funzione della posizione Z per ogni colonna di funzionalità rilevate in un dato stack di immagini per valutare la qualità dei profili di intensità del marcatore fiduciario. Entrambi DISP 3D.
m e taglio DISP. m insieme forniscono istogrammi del rumore di spostamento misurato in ciascuna delle dimensioni delle coordinate cartesiane e mappe di calore interpolate di spostamento. Inoltre, l'interp final3D_2.
m fornisce mappe di calore delle trazioni superficiali calcolate utilizzando il codice in outsourcing. La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che le soluzioni contenenti LAP sono sensibili alla luce e dovrebbero essere protette il più possibile da fonti di luce ambientale. Ricorda che NVP è un composto organico volatile e deve sempre essere maneggiato in una cappa a flusso chimico.
