Gli autori desiderano ringraziare il programma di iniziativa interdisciplinare Innovazione, Università di Illinois, concedere 12035. SK è stato finanziato a UIUC da National Science Foundation (NSF) Sovvenzione 0.965.918 IGERT: formare la nuova generazione di ricercatori in cellulari e su meccanismi molecolari e BioNanotechnology.

Realizzazione e funzionalizzazione PA gel di diversa rigidità con microsfere fluorescenti incorporate in prossimità della superficie di coltura cellulare. 1 funzionalizzare i coprioggetto piano in vetro <ol><li> Pulire i vetrini di vetro (# 1.0, diametro 12 mm.) Con acqua e sapone, seguito da etanolo per rimuovere la polvere estranei. </li><li> Posizionare il coperchio di vetro scivola su una superficie grattugiato (cioè titolare puntale) in modo che non si tocchino per facilitare la facilità di interazione con i coprioggetti. </li><li> Rivestire l&#39;intera superficie del coperchio scivola con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) per 1 ora (Figura 1A). </li><li> Durante questo tempo, eseguire una diluizione 1: 10.000 della soluzione di colloide di 0,1 micron di diametro, microsfere fluorescenti rossi con deionizzata (DI) per ottenere una densità di particelle di circa 1 a microsfere per 20 micron 2 sulla superficie del gel. Vedere la Figura 2 per i risultati delle varie diluizioni. Questo dilution può essere modificato per soddisfare l&#39;esigenza di esperimenti specifici. </li><li> Inserire la soluzione diluita in un bagno d&#39;acqua ad ultrasuoni per 30 minuti. </li><li> Dopo 1 ora, utilizzare pinzette per sollevare attentamente ogni vetrino e asciugare con aria. Riportare i vetrini asciutti in superficie grattugiato. </li><li> Rimuovere la soluzione colloidale diluita dal bagno ad ultrasuoni e pipetta 150 microlitri su ogni vetrino. Lasciare agire per 10 minuti (Figura 1B). </li><li> Utilizzare le pinzette per sollevare attentamente ogni vetrino e asciugare con aria. Riportare il coperchio secco scivola sulla superficie grattugiato e conservare al buio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2 Preparare PA Gel Direttamente Glass Bottom piastre di Petri <ol><li> Piastra Preriscaldare a 100 ° C. </li><li> Disporre il numero desiderato di fondo in vetro Petri (35 mm piatto con 14 millimetri micro-bene, # 1.0) su una superficie piana in una cappa. </li><li> Coprire la parte in vetro di ogni Petri piatto micro-bene con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) per 7 minuti per l&#39;attivazione chimica. Fare attenzione per evitare gocciolamento accidentale dei 3-APTES alla superficie della plastica nella scatola di Petri per evitare il degrado del polistirolo. </li><li> Dopo 7 minuti, riempire la piastra di Petri con acqua deionizzata e smaltire in contenitore per i rifiuti. </li><li> Ripetere il punto 2.4 3x per ogni piatto, e poi agitare la piastra di Petri per rimuovere l&#39;acqua in più. Porre le capsule di Petri sulla piastra calda fino a quando la parte in vetro è asciutto. </li><li> Rimuovere le piastre di Petri dalla piastra calda e tornare a una superficie piana in una cappa. </li><li> In una cappa, fare una soluzione di 0,5% di glutaraldeide e coprire la porzione di vetro di ciascuna piastra di Petri bene con la soluzione per 30 min. Fare attenzione per evitare gocciolamenti involontaria della glutaraldeide alla superficie della plastica nella scatola di Petri per evitare il degrado della plastica. </li><li> Dopo 30 minuti, riempire la piastra di Petri con acqua deionizzata e smaltire in contenitore per i rifiuti per risciacquare e rimuovere il glutaraldehyde. </li><li> Ripetere il punto 2.4 3x per ogni piatto, e poi agitare la piastra di Petri per rimuovere l&#39;acqua in più. Porre le capsule di Petri sulla piastra calda fino a quando la parte in vetro è asciutto. </li><li> Prima di miscelare i componenti della soluzione di gel PA, spostare i vetrini funzionalizzati nella cappa tale che siano facilmente accessibili, consentendo il rapido sandwiching del gel con il fondo di vetro piastre Petri dopo la miscelazione la soluzione di gel. </li><li> In una provetta da centrifuga da 15 ml, mescolare il 40% bisacrilammide, 2% acrilamide, e di acido acrilico in successione immediata alle concentrazioni elencate nella tabella 1 (adattato dal protocollo pubblicato 10) per ottenere l&#39;elasticità matrice desiderata. </li><li> Aggiungi HEPES 100 mM, 10% persolfato di ammonio, e TEMED in quantità elencate nella tabella 1 corrispondono a matrice di elasticità desiderato per completare la soluzione di gel. </li><li> Pipettare Subito 15 ml di soluzione di gel sul centro della porzione di vetrodelle piastre di Petri. </li><li> Prendere immediatamente una copertura di slittamento vetro funzionalizzato con una pinzetta. <ol><li> Capovolgere il vetrino di vetro sopra in modo che le perline fluorescenti sono sul contatto making lato con la soluzione di gel. </li><li> Disporre il vetrino delicatamente sulla sommità del gel PA ora-liquido tale che il lato funzionalizzato è in contatto con il gel (Figura 1C). Nota: Per ottenere i migliori risultati, una seconda persona è consigliato per il ruolo di aggiungere la polizza di copertura, al fine di evitare la possibilità di polimerizzazione parziale mentre pipettaggio soluzione di gel PA liquida su più piastre di Petri. </li></ol></li><li> Capovolgere tutti i piatti di Petri su per assistere evitare effetti gravitazionali sulle nanoparticelle fluorescenti polimerizzazione in più bassi livelli del gel PA. </li><li> Attendere almeno 35 minuti, o fino a quando la soluzione madre di gel PA ha visibilmente polimerizzato nella sua provetta da centrifuga. </li><li> Capovolgere le piastre di Petri indietro sopra e riempirli con PBS per assistere con la rimozione del vetrino. </li><li> Fare attenzione contatto con la porzione di vetro della piastra Petri e il contorno del vetrino, con una pinzetta per raschiare la circonferenza del vetrino. Eseguire diversi cicli fino a quando la polizza di copertura viene sloggiato. Rimuovere il vetrino e smaltire in un vero e proprio contenitore per rifiuti taglienti. </li><li> Dopo aver rimosso tutti i vetrini, perline fluorescenti saranno trasferiti al gel (Figura 1D). Coprire i gel PA completamente con PBS, posizionare il coperchio piastra di Petri su ogni piatto, e conservare a 4 ° C. </li></ol> 3. funzionalizzazione gel PA con fibronectina <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni premiscelate, come descritto in un protocollo prestabilito 11: Mettere a bagno la soluzione (137 mM NaCl, 5% (v / v) glicerolo) e tampone 2x coniugazione (0.2 M 2 (N -morpholino) Acido ethanesulfonic (MES), 10 % (v / v) glicerolo, pH 4,5). </li><li> Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere tutti PBS dai piatti con fondo di vetro che contengono i gel PA. </li><li> Pipettarete ammollo soluzione su ogni gel in modo che il gel sia completamente sommerso. Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li><li> Caldo 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare 10x soluzioni di EDC (150 mm, 19 mg / ml in acqua deionizzata) e NHS (250 mm, 29 mg / ml in acqua deionizzata). </li><li> Mescolare 1 parte di 10x EDC, 1 parte di 10x NHS, 3 parti di acqua DI, e 5 parti di 2x tampone coniugazione. </li><li> Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere la soluzione in ammollo. Assicurarsi che tutto il fluido viene rimosso dalla superficie del gel. </li><li> Aggiungere abbastanza soluzione NHS / EDC per coprire la superficie del gel e riempire il pozzo fondo di vetro della scatola di Petri (150-250 ml). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li><li> Fibronectina Scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelati, miscelare acqua deionizzata sterile per creare una / soluzione di fibronectina ml 50 mg. </li><li> Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere le solu NHS / EDCzione. Assicurarsi che tutto il fluido viene rimosso dalla superficie del gel. </li><li> Aggiungere 150 ml di soluzione di fibronectina a ciascun gel. Incubare a temperatura ambiente per 35 minuti per consentire fissaggio della fibronectina. </li><li> Dopo 35 minuti, aggiungere PBS ad ogni piastra di Petri e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. </li></ol> 4. Esperimenti Forza di trazione <ol><li> Mezzi pesanti cella, PBS, e tripsina a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Sciacquare gel 5x con PBS sterile, aspirare il PBS tra risciacqui, e lasciare coperto nel cappuccio. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina ogni 25 cm 2 per le cellule boccetta contenente. Dopo che le cellule vengono sollevati dal pallone, diluire il tripsina con supporto di cellule e contare le cellule. Sulla base della superficie del gel, determinare il numero di cellule necessarie per gel per un finale densità di semina cellulare di 3.000 cellule / cm 2. Diluire o concentrato sospensione tale che 150 ml di miscela di cellule-media contiene il numero di cellule. Aliquote di 150 ml di suspens cellulariion a ogni gel. </li><li> Porre le capsule Petri contenenti le cellule in un incubatore per 30 min. Quindi, rimuovere accuratamente le piastre di Petri e riempire il resto della piastra di Petri con i media (circa 2 ml) tale che la superficie del piatto è completamente sommerso. </li><li> Porre le capsule di Petri torna in incubatrice fino acquisizione delle immagini. </li><li> Preparare il sistema di acquisizione dati microscopio e per l&#39;imaging: inserire l&#39;obiettivo ad immersione 40x acqua, inserire il contrasto di interferenza differenziale (DIC) prisma, selezionare il mCherry o il filtro fluorescente equivalente, e accendere la camera ambientale. </li><li> Quando preparate per l&#39;imaging, rimuovere una piastra di Petri dal termostato e posizionarlo delicatamente sul palco microscopio. Togliere il coperchio piatto di Petri per l&#39;imaging DIC. </li><li> Individuare una singola cella e catturare una singola immagine fissa della cella in DIC. </li><li> Senza spostare il palco microscopio, cambiare la modalità di imaging di fluorescenza. Focus sulle microsfere fluorescenti e recORD un&#39;immagine delle microsfere. </li><li> Rimuovere con attenzione supporti cella dalla piastra di Petri con una pipetta e aggiungere 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Immagine le microsfere sotto la cella dopo che le cellule hanno staccato. </li><li> Usa particella immagine velocimetry (PIV) analisi in ImageJ 12 per calcolare il campo di spostamento a causa di forze cellulari. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. 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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Quando si utilizza questa tecnica, è essenziale che la soluzione tallone è correttamente diluito e le perline sono scelti in base a diametro desiderato, PA substrato gel rigidità, e la scala di grandezza dei fenomeni che è esplorato nell&#39;esperimento desiderato. Si deve usare cautela quando si diluisce la soluzione tallone prima di funzionalizzazione migliori scivola copertura in vetro. La spaziatura tra le perle sulla superficie del gel può essere modificata variando il fattore di d...

L&#39;interazione meccanica di una cellula vivente con il suo ambiente locale è stato comunemente studiata utilizzando gel PA. Questi substrati basano su un semplice protocollo ben caratterizzato stabilito da Dembo e Wang nel 1997 1. Uno dei principali vantaggi di questi substrati è che la loro rigidezza può essere regolato modificando le concentrazioni dei componenti specifici della soluzione di gel. Ciò fornisce una piattaforma auspicabile studiare l&#39;interazione cellule &#39;con ambienti di diverse rigidità. Quando gel PA vengono rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine, cellule aderiscono ad esse, la forza che genera. Come risultato della forza cella, il gel si deforma come un corpo elastico. Questa deformazione dipende dalla grandezza della forza applicata dalle cellule e le proprietà elastiche del gel. Vari studi hanno impiegato gel PA per indagare le forze di trazione cellulari. In una variante di PA gel fabbricazione, microsfere fluorescenti (sfere) sono incorporati tel corso il gel di quantificare le forze di trazione cellulare su gel di differenti rigidità 2. Su di applicazione della forza di cellule, le perle spostano dalla loro posizione iniziale dopo gel deformazione. Il campo di deformazione è misurata dai singoli spostamenti tallone. Questo campo di deformazione viene utilizzata con la teoria dell&#39;elasticità e le proprietà elastiche del gel per calcolare le forze di trazione. Queste misure forniscono informazioni su come le cellule percepiscono meccanicamente ed interagiscono con il loro microambiente locale 3. In molti protocolli gel di fabbricazione ampiamente utilizzati PA, le perle sono mescolati in tutto il gel PA nel suo, stato liquido non polimerizzato. Un gel completamente polimerizzato PA contiene perline fluorescenti in tutto il suo volume. Nel calcolo delle forze di trazione delle cellule, perline maggior parte vicino alla superficie del gel (interfaccia cellula-substrato) sono monitorati. Gli spostamenti di queste perle si presume che si verificano sulla superficie della coltura cellulare per semplicità nella CALCOLO vigoren. La posizione attuale delle perle all&#39;interno della profondità del gel viene ignorato. Tuttavia, in un mezzo elastico (ad esempio gel PA), una perlina più vicino al punto di applicazione della forza si muoverà più di un cordone che è più lontano dal punto. Così, trattando lo spostamento di un punto (nella posizione tallone) distale dalla superficie come che i risultati di superficie in una sottostima del trazioni cellulari. Il grado di errore dipende dalla distanza del tallone dalla superficie. L&#39;errore non può essere definita senza la conoscenza della posizione del tallone. La necessità di un metodo semplice per limitare perline molto vicino alla superficie di coltura cellulare è stato affrontato da alcune tecniche. Un modo è quello di aumentare la densità di perline per tutto l&#39;arco gel tale che ci sia un numero sufficiente di perline nel piano focale superiore per misurare il movimento molto vicino alla superficie. Un&#39;altra tecnica prevede la costruzione di una camera di imaging confocale per l&#39;imaging cellulare dal vivo in modo tale che la luce dasolo le perline nel piano superiore più focale è raccolto 4. Un altro metodo consiste sovrapponendo uno strato estremamente sottile di PA gel contenente microsfere sulla cima di un gel già polimerizzato, senza perline 5. Un inconveniente di ciascuna di queste tecniche è che la posizione precisa dei branelli all&#39;interno del gel non è noto. Questo introduce errori nel calcolo del campo di spostamenti delle perline, e quindi il calcolo delle forze cellulari. Un&#39;altra tecnica prevede coniugazione perline alla superficie superiore di un gel PA già polimerizzato usando solfo-SANPAH 6. Questa tecnica garantisce le perline sono infatti solo sulla parte superiore del gel PA, ma la misura in cui sono incorporati nella profondità del gel è sconosciuta. Ciò potrebbe potenzialmente creare una topografia locale per le cellule, che potrebbero alterare il comportamento delle cellule, come il lavoro preliminare ha suggerito che le cellule possono percepire forza diversi micron di distanza 7. Recentemente, una tecnica per patterning gel PA con 1 micron di diametro fluorescent marcatori fibronectina punti in una matrice regolarizzato è stato fondato 8. In questo caso, la profondità dei marcatori fluorescenti è noto, ed è sostanzialmente pari a zero, come il modello fibronectina è indirettamente stampata sulla superficie del gel. Tuttavia, questo metodo non fornisce un ambiente continuo in cui le cellule possono attaccare, come la proteina ECM è limitata a 1 micron di diametro puntini. Deve essere ancora stabilito un metodo per integrare pienamente perline Tracker all&#39;interno gel PA e loro confinamento in un percorso noto molto vicino alla superficie. Qui, sviluppiamo una tecnica per limitare sub-micron di perline fluorescenti di diametro micron ad un piano focale molto vicino alla superficie di coltura cellulare all&#39;interno del gel PA. Un gel è tipicamente curata da sandwich non polimerizzato soluzione di gel liquido tra due lastre di vetro. Una delle piastre viene funzionalizzati in modo che il gel aderisce fortemente ad esso. L&#39;altro è unfunctionalized e viene rimosso dopo le cure del gel. Modifichiamo questo vetro rimovibile surfaccia rivestendo con uno strato di perline. Su sandwich il gel liquido tra il funzionalizzati e la superficie di vetro tallone rivestito, il trasferimento di perline per il gel mentre sta curando. Questo limita la distanza di integrazione dei branelli &#39;nel gel entro 1,6 micron della superficie. Piatti con fondo di vetro Petri sono utilizzati come la superficie di adesione sulla quale è guarito il gel. Per formare una superficie superiore piana del gel durante la polimerizzazione, una circolare copertura in vetro antiscivolo è usato per sandwich di gel con la piastra di Petri con fondo di vetro. Prima di gel di fabbricazione, il coperchio superiore in vetro antiscivolo è rivestito con poli-D-lisina (PDL), ottenendo una carica superficiale positiva. Il Pdl è saltato fuori con aria compressa, e una soluzione di perline in acqua si deposita sulle coprioggetto. Utilizziamo microsfere fluorescenti carbossilati, che portano una carica negativa, e interagire con la superficie carica positiva creata dal trattamento con PDL. Dopo aver soffiato la soluzione tallone fuori il vetrino con aria compressa, un singolo strato diperline rimane elettrostaticamente accoppiati alla copertura di slittamento asciutto. Il rivestimento PDL non influenza l&#39;adesività del vetro alla superficie del gel, i vetrini sono integri e rimossa dal gel PA completamente intatto. Le piastre di Petri con fondo di vetro sono fatti aderente dal trattamento con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane e 0,5% glutaraldeide. PA gel di rigidità desiderati vengono creati miscelando opportune concentrazioni di bisacrilammide e acrilamide mediante una procedura standard 9. Una goccia della soluzione di gel è pipettati sul piatto di Petri con fondo di vetro. Il vetrino di vetro contenente le perline viene utilizzato per sandwich di gel con la piastra di Petri. Quando il gel è guarito, la fodera superiore viene rimosso lasciando le sferette incorporati nel gel PA a 1,6 micron dalla superficie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

Gel PA sono stati a lungo utilizzati come piattaforma per studiare le forze di trazione delle cellule grazie alla facilità di fabbricazione e la possibilità di regolare le loro proprietà elastiche. Quando il substrato viene rivestito con una proteina della matrice extracellulare, le cellule aderiscono al gel e applicare forze, causando il gel di deformarsi. La deformazione dipende dalla trazione cellulare e le proprietà elastiche del gel. Se il campo di deformazione della superficie è noto, la trazione superficiale può essere calcolata utilizzando la teoria dell&#39;elasticità. Gel deformazione viene comunemente misurata inserendo perline marcatori fluorescenti uniformemente nel gel. Le sonde spostano come il gel si deforma. Le sonde vicino alla superficie del gel sono tracciati. Gli spostamenti riportati da queste sonde sono considerati come spostamenti superficiali. Le loro profondità dalla superficie vengono ignorati. Questa ipotesi introduce errore in forza di trazione valutazioni. Per la misura precisa di forze di cellule, è fondamentale per la posizione delle perline per essere conosciuto. Abbiamo sviluppatouna tecnica che utilizza la chimica semplice confinare perline marcatori fluorescenti, 0,1 e 1 micron di diametro, in gel PA, a 1,6 micron della superficie. Abbiamo cappotto un coprioggetto con poli-D-lisina (PDL) e perline fluorescenti. Soluzione di gel PA viene quindi inserita tra il vetrino ed una superficie aderente. Le perline fluorescenti trasferimento alla soluzione di gel durante la polimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, il gel PA contiene microsfere fluorescenti su un aereo vicino alla superficie del gel.

L&#39;imaging confocale è stato utilizzato per determinare che le perle erano effettivamente sotto la superficie del gel e di quantificare la loro collocazione precisa all&#39;interno della profondità di gel. Perline fluorescenti di una lunghezza d&#39;onda diversa da quelle all&#39;interno del gel sono stati lasciati depositare sulla superficie, e la distanza tra le nanoparticelle fluorescenti incorporate e quelle sulla superficie è stata calcolata utilizzando un algoritmo di identificazione centroide. La posizione ...

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel. 

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all&#39;interno di liposomi come strumento per<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Microscopia a forza di trazione per studiare l'attivazione dei linfociti B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...