Questo lavoro è stato sostenuto dall'Unione Europea dal Fondo europeo di sviluppo regionale nell'ambito del programma operativo sviluppo della Polonia orientale 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), dalla Facoltà di Biotecnologie e Scienze Ambientali dell'Università Cattolica Giovanni Paolo II di Lublino (sovvenzione giovani scienziati per Ilona Sadok), Centro nazionale di scienze polacco, OPUS13 (25/2017/B/NZ4/01198 per Magdalena Staniszewska, Principle Investigator).  Gli autori ringraziano la Prof.ssa Agnieszka Ścibior del Laboratorio di Stress Ossidativo, Centro per la Ricerca Interdisciplinare, JPII CUL per aver condiviso le attrezzature per la recupero cellulare e la quantificazione delle proteine.

1. Preparazione di soluzioni standard standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock
<ol><li>Pesare i reagenti in una fiala con la massima precisione (0,3 mg ciascuno). Per una migliore precisione, scalare i reagenti, regolando il volume del solvente in base al passaggio 1.2.</li>
	<li>Sciogliere i reagenti in 300 μL del solvente per ottenere una soluzione stock di 1 g/L. Sciogliere 3NT in acido formico 1% (v/v) (FA) in acqua; Kyn, 3HAA e XA in solfossido di dimetile (DMSO); 3HChin in acqua acidificata a pH 2,5 con acido cloridrico (HCl). ATTENZIONE: 3HAA irrita occhi, naso, gola e polmoni. È dannoso se inalato, a contatto con la pelle e se ingerito. Indossare una protezione appropriata, ad esempio guanti e maschera.</li>
	<li>Chiudere saldamente il flaconcino e posizionarlo in un bagno ad ultrasuoni per 1 minuto per accelerare la dissoluzione. NOTA: Conservare le soluzioni stock a -20 °C e ridurre al minimo il congelamento/scongelamento (3 cicli al massimo) a causa dell'instabilità delle soluzioni stock.</li>
</ol>2. Preparazione del mezzo di coltura trattato a carbone
<ol><li>In un tubo pesare 280 mg di carbone attivo e aggiungere 5 ml del mezzo liquido preparato per coltivare le cellule di interesse.</li>
	<li>Agitare il tubo con il supporto e il carbone su un rocker a sega trasparente per 2 ore, a temperatura ambiente (impostare la velocità su 50 oscillazioni / min). Quindi, centrifugare i tubi a 6000 x g per 15 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dalla centrifuga e raccogliere con cura il supernatante senza disturbare il sedimento. Ripetere la centrifugazione, se necessario, per rimuovere tutti i residui di carbone.</li>
	<li>Filtrare il supernatante utilizzando un filtro siringa da 0,45 μm.</li>
	<li>Assicurarsi che il mezzo di coltura pretrattato a carbone sia privato delle tracce di cinurenine eseguendo un campione pilota su LC-MS come descritto al passaggio 6.3.2. In caso contrario, ripetere i passaggi 2.1-2.4. NOTA: Se il mezzo di coltura completo inizialmente non contiene cinurenine, la fase di purificazione con carbone potrebbe essere omessa. In questo caso, preparare standard di calibrazione e campioni di controllo qualità utilizzando il mezzo completo solitamente preparato per la coltivazione cellulare.</li>
	<li>Conservare il mezzo preparato a 4 °C fino all'analisi.</li>
</ol>3. Realizzare le soluzioni di calibrazione e le curve di calibrazione
<ol><li>A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e aggiungere quattro standard (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) almeno a sei diverse concentrazioni per coprire gli intervalli di calibrazione. Mantenere il volume finale di ciascun campione a 150 μL. Utilizzare tubi di centrifuga da 1,5 ml per la preparazione del campione. NOTA: Punti di calibrazione suggeriti per 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; per Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; per 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; per XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di metanolo freddo (mantenuto a -20 °C) contenente l'1% (v/v) di acido formico in ciascun tubo per la deproteinizzazione del campione. Chiudere saldamente bene i tubi e il vortice.</li>
	<li>Incubare i campioni a -20 °C per 40 min.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Rimuovere i tubi dalla centrifuga. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il sedimento.</li>
	<li>Trasferire 270 μL del supernatante nel flaconcino di vetro utilizzando una pipetta automatica. Mettere le fiale nell'evaporatore ed evaporare delicatamente fino a quando non si asciuga. Utilizzare il programma appropriato per le frazioni acqua/metanolo per evaporare i componenti volatili. Non applicare temperature superiori a 40 °C ed evitare un'asciugatura troppo. NOTA: Le fiale di vetro a fondo piano, cioè le fiale cromatografiche facilitano un'evaporazione più rapida e recuperi più elevati rispetto ai tubi conici in plastica.</li>
	<li>Dopo 30 minuti, controllare lo stato di evaporazione. Se necessario, continuare l'evaporazione (ad esempio, aggiungere altri 10 minuti). Evitare un'asciugatura troppo.</li>
	<li>Rimuovere le fiale dall'evaporatore. Ricostituire ciascun campione in 60 μL dello 0,1% (v/v) di acido formico in acqua. Aggiungere il solvente nel flaconcino contenente il materiale residuo. Chiudere saldamente le fiale e il pozzo del vortice.</li>
	<li>Trasferire il campione in un tubo da 1,5 ml e girare a 14.000 x g per 15 minuti a 4 °C per separare la proteina precipitata.</li>
	<li>Senza disturbare il pellet proteico, trasferire i supernatinanti in flaconcini cromatografici con inserti in vetro conico con pipetta automatica. Chiudere saldamente le fiale.</li>
	<li>Verificare la presenza di bolle d'aria nel flaconcino inserto e rimuoverle se necessario (ad esempio, mediante vortice).</li>
	<li>Trasferire i flaconcini cromatografici contenenti campioni nell'autocampionatore LC. Registrare la posizione dei campioni inseriti in un vassoio di campionamento automatico.</li>
</ol>4. Preparazione di campioni di controllo qualità (QC)
<ol><li>A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone (preparato in un tubo centrifugo da 1,5 ml) con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e standard di quattro cinurenine (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ad una concentrazione selezionata dall'intervallo lineare delle curve di taratura. Mantenere il volume finale del campione a 150 μL. NOTA: Se applicabile, preparare più campioni di QC a diverse concentrazioni che rientrano nell'intervallo lineare della curva di calibrazione.</li>
	<li>Seguire il protocollo descritto nella sezione 3 (passaggi 3.2-3.11).</li>
</ol>5. Configurazione del sistema LC-MS
<ol><li>Preparare i solventi di fase mobile: Solvente A: formato ammonio da 20 mmol/L in acqua ultrapura (pH 4.3 regolato con acido formico); Solvente B: acetonitrile al 100%. NOTA: Utilizzare solo bottiglie di vetro borosilicato. Risciacquare le bottiglie con acqua ultrapura prima di riempirle. Non utilizzare bottiglie pulite con detergenti. ATTENZIONE: Acetonitrile provoca gravi effetti sulla salute o morte. È facilmente infiammabile dal calore. Acetonitrile liquido e vapore possono irritare occhi, naso, gola e polmoni.<ol>
<li>Preparare 5 mol/L di soluzione stock di formato ammonio sciogliendo un reagente cristallino (15,77 g) in 50 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro. Mescolare fino a quando tutti i residui si dissolvono. Filtrare attraverso la membrana di 0,45 μm per rimuovere eventuali detriti residui (ad esempio, utilizzando un filtro per siringhe di nylon). Conservare la soluzione stock a 4 °C.</li>
		<li>Preparare il solvente A aggiungendo 4 ml di formato ammonio 5 mol/L in acqua a 980 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro ambrato e mescolare bene. Immergere una barra di agitazione e mettere la bottiglia con il solvente su un agitatore magnetico. Immergere un elettrodo di pH nella soluzione e controllare il pH sotto agitazione. Aggiungere la soluzione di stock di acido formico (98%-100%) dropwise utilizzando una pipetta automatica con punta da 0,2 mL per ottenere pH 4.3, regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura e mescolare bene. NOTA: Preparare i solventi almeno una volta alla settimana per prevenire qualsiasi crescita microbica. ATTENZIONE: L'acido formico (FA) è tossico se inalato, provoca ustioni cutanee e danni agli occhi. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.</li>
		<li>Filtrare tutte le soluzioni attraverso la membrana da 0,22 μm (ad esempio, filtro siringa di nylon) per rimuovere eventuali detriti residui. Facoltativamente, utilizzare i filtri di ingresso del solvente dedicati ai serbatoi di solvente LC per proteggere il sistema dalle particelle in arrivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Avviare il software di controllo e acquisizione dati LC-MS.</li>
	<li>Eliminare il sistema LC con la fase mobile per rimuovere le bolle e innescare tutti i canali del solvente.</li>
	<li>Ensemble una colonna di guardia per proteggere la colonna analitica dall'intasamento.</li>
	<li>Lavare la protezione e la colonna analitica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) con acetonitrile al 100% per circa 30 minuti, e quindi con solvente al 100% A fino a quando non si osserva una pressione stabile nella colonna. Controllare le prestazioni del sistema utilizzando il software di controllo.</li>
	<li>Impostare i parametri LC appropriati nel software di acquisizione dati.<ol>
<li>Impostare il programma di gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.</li>
		<li>Impostare la portata di fase mobile a 0,15 mL/min, il tempo di esecuzione totale dell'analisi per 45 minuti, la temperatura della colonna a +40 °C e il volume di iniezione a 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostate i parametri di acquisizione del rivelatore di spettrometria di massa.<ol>
<li>Applicare parametri di ionizzazione: monitoraggio ionica singola (SIM), ionizzazione positiva, pressione nebulizzatore di 50 psi, +350 °C temperatura del gas di essiccazione, flusso di gas di essiccazione di 12 L /min e tensione capillare di 5500 V.</li>
		<li>Selezionare gli ioni di monitoraggio degli aliti: per 3HKyn m/z 225.0 (periodo di scansione: 2-6 min, fragmentor voltage: 100 V); per Kyn m/z 209.0 (periodo di scansione: 6-12 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3HAA m/z 154,0 (periodo di scansione: 12-18 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3NT m/z 227,0 (periodo di scansione: 18-23 min, tensione frammentaria: 100 V); per XA m/z 206.0 (periodo di scansione: 23-45 min, tensione frammentaria: 100 V).</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire un worklist ed eseguire esempi nel sistema LC.</li>
	<li>In un primo momento, prima dell'analisi dei campioni sperimentali, eseguire un campione vuoto (solvente A) almeno in triplicati, seguito da un campione di QC.</li>
	<li>Aprire il software di analisi dei dati e caricare i risultati ottenuti per il campione qc.</li>
	<li>Controllare la posizione dei picchi di aliti sul cromatogramma. Quando i segnali si spostano oltre la posizione prevista, regolare i cancelli del tempo per un'adeguata raccolta di segnali di aliti. Consultare il manuale del software per istruzioni sull'integrazione del segnale.</li>
</ol>6. Costruire la curva di calibrazione
<ol><li>Nel software di acquisizione dati aggiungere standard di calibrazione nell'elenco di lavoro ed eseguire gli standard nei triplicati.</li>
	<li>Integrare e misurare l'area di picco corrispondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA al tempo di ritenzione di circa 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, rispettivamente.</li>
	<li>Costruisci curve di calibrazione individuali per ogni metabolita utilizzando un programma di fogli di calcolo.<ol>
<li>Per creare il grafico di calibrazione, tracciare il valore per un rapporto tra l'area di picco dell'aalita sull'area di picco 3NT e la concentrazione dell'a analitico.</li>
		<li>Analizzare il campione vuoto (mezzo di coltura pretrattato a carbone puntato solo con 3NT) per assicurarsi che non vi sia traccia degli aliti studiati nel mezzo. In caso contrario, sottrarre il valore ottenuto da ogni punto di calibrazione.</li>
		<li>Controllare la linearità di ogni curva di calibrazione.<ol>
<li>Individualmente, per ogni a analitico, creare un'equazione lineare di intercetta di pendenza (y = ax +b), dove y corrisponde al rapporto tra l'area di picco dell'a analitico e l'area di picco 3NT, a è la pendenza, x è la concentrazione di a analitici (μmol/L), e b si riferisce all'intercetta della curva. Tracciando il grafico 'y' contro 'x' verrà generato la curva di calibrazione.</li>
			<li>Aggiungere una linea di tendenza lineare al grafico, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico. Assicurarsi che il coefficiente di regressione sia > 0,990. In caso di standard di calibrazione non corrispondenti, prepararli e/o analizzarli ancora una volta. Facoltativamente, modificare l'intervallo di concentrazione della curva di calibrazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analizzare i campioni qc per verificare le prestazioni del sistema prima di analizzare i campioni sperimentali. In caso di incompatibilità (± 20% dal valore di riferimento), preparare le nuove curve di calibrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Coltura cellulare in vitro e raccolta di campioni per l'analisi
<ol><li>Placcare le cellule tumorali studiate (MDA-MB-231 o SK-OV-3) in DMEM (Medium dell'Aquila Modificata di Dulbecco) contenenti 4,5 g/L di ᴅ-glucosio, 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutammina e 1 U penicillina/streptomicina e coltura a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 per espanderli per l'esperimento. Passare le cellule all'80% della confluenza.</li>
	<li>Staccare le cellule dal piatto di coltura usando tripina, seme per l'esperimento su piastre a 12 po 'ad una densità di 0,3 × 106 cellule per pozzo e posto in un'incubatrice durante la notte.</li>
	<li>Il giorno dopo, aspirare il mezzo di coltura e aggiungere DMEM fresco con o senza l'aggiunta dei composti studiati, a seconda del design sperimentale.</li>
	<li>Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo dall'alto delle cellule (circa 500 μL) in un tubo da 1,5 ml. Centrifuga a 14.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. Raccogliere il supernatante e conservare a -80 °C fino all'analisi.</li>
	<li>Salvare il pellet cellulare dal passaggio 7.4 per la stima delle proteine. Congelare i campioni a -20 °C. NOTA: I risultati ottenuti per un mezzo da pozzi diversi devono essere normalizzati al contenuto proteico totale per tenere conto della variabilità del numero di cellule nei singoli pozzi. La concentrazione proteica può essere valutata come descritto nella fase 9.</li>
</ol>8. Preparare campioni per l'analisi LC-MS
<ol><li>Scongelare il campione congelato a temperatura ambiente e mescolare bene. Trasferire 149,25 μL del mezzo di coltura in un tubo di centrifugazione (1,5 ml).</li>
	<li>Aggiungere 0,75 μL di 0,1 g/L di soluzione 3NT (standard interno). Chiudere bene i tubi e il vortice.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di metanolo refrigerato a -20 °C contenente 1% (v/v) FA per la deproteinizzazione del campione. Chiudere bene i tubi e il vortice.</li>
	<li>Continuare con la preparazione del campione come descritto nella sezione 3 (passaggi 3.3-3.11). NOTA: Alcune cellule tumorali come SK-OV-3 secernono grandi quantità di Kyn in un mezzo di coltura. Per inserire i dati in un intervallo lineare della curva di calibrazione, è necessaria una diluizione di circa 100 volte del campione. In questo caso, diluire una porzione del campione con 0,1% (v/v) FA in acqua e analizzare oltre al campione non diluito. I campioni di riferimento delle norme per la curva di taratura devono essere preparati in un terreno di coltura completo diluito 100 volte. In alternativa, aggiungere più punti nella curva di calibrazione (se si ottengono una corretta solubilità e linearità) per adattarlo al livello di concentrazione di Kyn nel campione sperimentale.</li>
	<li>Analizzare i campioni per LC-MS come descritto nella sezione 5. Costruire un elenco di lavoro ed eseguire ogni esempio in triplice copia.</li>
	<li>Una volta completato l'elenco di lavoro, misurare l'area di picco dell'alita.</li>
	<li>Generare un foglio di calcolo utilizzando il software disponibile e ottenere dati numerici.</li>
	<li>In una colonna del foglio di calcolo calcolare il rapporto dell'area di picco dell'alyte sull'area di picco 3NT.</li>
	<li>Utilizzare una singola equazione di calibrazione lineare dedicata per ogni alita (dal passaggio 6.3.) per calcolare le concentrazioni di aliti presenti nei campioni sperimentali.</li>
</ol>9. Valutazione del contenuto proteico e normalizzazione dei dati
<ol><li>Resopendare il pellet cellulare dal passaggio 7.5 con 100 μL di salina tamponata da fosfati (PBS) in tubo da 1,5 ml. NOTA: Preparare la soluzione di PBS sciogliendo 8 g di cloruro di sodio, 0,2 g di cloruro di potassio, 1,44 g di dibasico di fosfato di sodio, fosfato di diidrogeno di potassio in 950 mL di acqua ultrapura. Mescolare bene. Regolare il pH a 7,4 con acido cloridrico (dropwise). Regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura. Mescolare bene fino a omogeneo. ATTENZIONE: L'acido cloridrico è altamente corrosivo e deve essere maneggiato con adeguate precauzioni di sicurezza. Il contatto con la pelle umana può causare arrossamento, dolore, ustioni cutanee. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.</li>
	<li>Congelare i campioni a -20 °C e poi scongelarsi sul ghiaccio. Ripetere questo passaggio 3x.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il pellet.</li>
	<li>Diluire i supernatanti 10x con PBS.</li>
	<li>Costruire una curva di calibrazione da 0 a 2 μg della proteina per intervallo di pozzi.<ol>
<li>Preparare la soluzione standard di albumina di siero bovino (BSA) per la calibrazione. Sciogliere 1,23 μg di BSA in 1 mL di acqua ultrapura e pozzo vortice.</li>
		<li>Su una piastra da 96 pozza, caricare diverse quantità di soluzione standard BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.</li>
		<li>Riempire il pozzo con PBS al volume finale di 50 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caricare 10 - 15 μL di lire cellulare dal passo 9.4 sulla stessa piastra da 96 pozzi. Riempire i pozzi con PBS per raggiungere il volume finale di 50 μL. NOTA: Se necessario, regolare il volume dell'aliquota di lysate della cella in ogni pozzo per adattarlo all'intervallo lineare della curva di calibrazione. Mantenere il volume finale a 50 μL del campione per pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di un reagente di Bradford (diluito 5 volte con acqua ultrapura) ad ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare il patè da 96 pozzi per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Inserire la piastra in un lettore di micropiastrine. Misurare l'assorbanza a λ = 595 nm.</li>
	<li>Costruire una curva di calibrazione utilizzando un programma di foglio di calcolo. Tracciare la quantità di BSA (μg) rispetto all'assorbanza. Aggiungere una linea di tendenza lineare, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico.</li>
	<li>Usa l'equazione lineare (y = ax +b, dove y corrisponde all'assorbanza a λ = 595 nm, a è la pendenza, x è un contenuto proteico (μg), e b si riferisce all'intercetta della curva) per calcolare la quantità proteica nel campione. NOTA: si consideri un fattore di diluizione del campione nei calcoli.</li>
	<li>Utilizzare il contenuto proteico stimato per normalizzare la quantità di cinurenina nel campione per 1 mg di proteine. Per fare questo, dividere la concentrazione di cinurenine determinata nella fase 8.9 con il contenuto proteico totale dal passo 9.10.</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites.">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li><li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites,+tryptophan,+monoamines+and+neopterin+in+plasma,+cerebrospinal+fluid+and+brain.">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li><li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li><li>M&#246;ller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan,+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma.">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li><li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites.">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li><li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection.">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li><li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection.">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li><li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum.">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).</li><li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan,+kynurenine,+kynurenic+acid,+and+quinolinic+acid+in+human+plasma.">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li><li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+LC-MS/MS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients.">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li><li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography/electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum,+urine,+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li><li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes.">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li><li>Sadok, I., Rachwa&#322;, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells.">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li><li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression+in+mass+spectrometry.">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li><li>Hou&#233;e-L&#233;vin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine:+An+update+on+mechanisms+of+formation,+advances+in+analysis+and+biological+consequences.">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2,+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage.">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , (2019).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes.">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416 (2009).</li><li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine+2,3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins,+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens.">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento presenta un protocollo dettagliato LC-SQ per la quantificazione simultanea di quattro principali metaboliti Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) che vengono misurati in un mezzo da cellule tumorali umane coltivate in vitro. Particolare attenzione è rivolta alla preparazione del campione, alla procedura cromatografica/spettrometrica di massa e all'interpretazione dei dati, i punti più importanti all'interno dell'analisi.
In generale, l'analisi LC-MS, a causa dell'elevata sensi...

La via della kynurenina (KP) è la principale via del catabolismo triptofano (Trp) nelle cellule umane. L'indoloammina-2,3-diossigenasi (IDO-1) nelle cellule extraepatiche è il primo e limitante enzima di KP e converte il Trp in N-formilchinurenina1. Ulteriori passaggi all'interno di KP generano altri metaboliti secondari, vale a dire le cinurenine che mostrano varie proprietà biologiche. La cinurenina (Kyn) è il primo catabolita Trp stabile che mostra proprietà tossiche e regola gli eventi cellulari dopo il legame con il recettore degli idrocarburi arilici (AhR)2. Successivamente, Kyn viene trasformato in diverse molecole spontaneamente o nei processi mediati dall'enzima, generando tali metaboliti come 3-idrossichinurenina (3HKyn), acido antranilico (AA), acido 3-idrossiantranilico (3-HAA), acido cinurenico (Kyna) e acido xanturenico (XA). Un altro metabolita a valle, 2-ammino-3-acido carbossimuconico-6-semialdeide (ACMS), subisce ciclizzazione non enzimatica in acido čolinico (QA) o acido picolinico (PA)1. Infine, il QA viene ulteriormente trasformato in nicotinammide-adenina dinucleotide (NAD+)3, il metabolita del punto finale KP che è un importante cofattore enzimatico. Alcune kynurenine hanno proprietà neuroprotettive come Kyna e PA, mentre le altre, cioè 3HAA e 3HKyn, sono tossiche4. L'acido xantinonico, che si forma da 3HKyn, presenta proprietà antiossidanti e vasorelaxation5. XA si accumula nelle lenti che invecchiano e porta all'apoptosi delle cellule epiteliali6. KP, descritto a metà del XX secolo, haguadagnato maggiore attenzione quando è stato dimostrato il suo coinvolgimento in vari disturbi. L'aumento dell'attività di questa via metabolica e l'accumulo di alcune cinurenine modulano la risposta immunitaria e sono associate a diverse condizioni patologiche come depressione, schizofrenia, encefalopatia, HIV, demenza, sclerosi laterale amiotrofica, malaria, Alzheimer, malattia di Huntington e cancro4,7. Alcuni cambiamenti nel metabolismo Trp si osservano nei microambientati tumorali e nellecellule tumorali 2,8. Inoltre, le cinurenine sono considerate marcatori di malattia promettenti9. Nella ricerca sul cancro, i modelli di coltura cellulare in vitro sono ben consolidati e ampiamente utilizzati per la valutazione preclinica delle risposte ai farmaci anticancro10. I metaboliti Trp sono secreti dalle cellule nel mezzo di coltura e possono essere misurati per valutare lo stato della via della cinurenina. Pertanto, è necessario sviluppare metodi appropriati per il rilevamento simultaneo del maggior numero possibile di metaboliti KP in una varietà di campioni biologici con un protocollo facile, flessibile e affidabile.
In questo articolo, descriviamo un protocollo per la determinazione simultanea di quattro metaboliti della via della cinurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA da LC-SQ in un mezzo post-coltura raccolto dalle cellule tumorali. In un moderno approccio analitico, la cromatografialiquida 13,14,15,16 è preferita per il rilevamento simultaneo e la quantificazione dei singoli cataboliti di triptofano, a differenza dei saggi biochimici non specifici che utilizzano il reagente di Ehrlich11,12. Attualmente, ci sono molti metodi disponibili per la determinazione delle cinurenine in campioni umani, principalmente basati sulla cromatografia liquida con rivelatori ultravioletti o a fluorescenza13,17,18,19. La cromatografia liquida accoppiata con un rivelatore di spettrometria di massa (LC-MS) sembra più adatta per questo tipo di analisi, a causa della loro maggiore sensibilità (limiti inferiori di rilevamento), selettività e ripetibilità.
I metaboliti Trp sono già stati determinati nel siero umano, plasma e urina13,20,21,22,23, tuttavia, sono desiderati anche i metodi per altri campioni biologici, come il mezzo di coltura cellulare. In precedenza, l'LC-MS era usato per composti derivati dal Trp in un mezzo raccolto dopo la coltura di cellule di glioma umano, monociti, cellule dendritiche o astrociti trattati con gamma di interferone (IFN-γ)24,25,26. Attualmente, sono necessari nuovi protocolli convalidati che possono consentire una valutazione di diversi metaboliti in diversi mezzi di coltura, cellule e trattamenti utilizzati nei modelli di cancro.
Lo scopo del metodo sviluppato è quello di quantificare (all'interno di una serie analitica) quattro principali cinurenine che possono indicare anomalie in KP. Ecco le fasi critiche del nostro protocollo recentemente pubblicato per l'analisi quantitativa LC-SQ di alcune cinurenine significative selezionate utilizzando uno standard interno (3-nitrotirosina, 3NT) nel mezzo raccolto da cellule tumorali umane coltivate in vitro 27. Per quanto ne siamo a conoscenza, è il primo protocollo LC-SQ per la quantificazione simultanea di 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA in un mezzo di coltura ottenuto dalle cellule coltivate in vitro. Dopo alcune modifiche, il metodo potrebbe essere ulteriormente applicato per studiare i cambiamenti nel metabolismo Trp in una gamma più ampia di modelli di coltura cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1360px;" width="1359">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-hydroksy-DL-kynurenina</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">H1771</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-hydroxyanthranilic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">148776</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>1.00029</td>
			<td>hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>05105</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:175px;">Ohaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:411px;">Analytical column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>959764-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">7022</td>
			<td>eluent additive for LC-MS, LiChropur, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>1001887398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps for chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>blue screw caps,PTFE/red sil sepa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>704004</td>
			<td>polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td style="width:175px;">Biologix</td>
			<td>07-6012</td>
			<td>12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>HERAcell 150i Cu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5415R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-2278</td>
			<td>Eppendorf type, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-3693</td>
			<td>Falcon type, 50 mL, PP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic data acqusition and analysis software</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic insert vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-1387</td>
			<td>100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td>2 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">1.02950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dubelcco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:175px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-41450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dual meter pH/conductivity</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>SevenMulti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evaporator</td>
			<td style="width:175px;">Genevac</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model EZ-2.3 Elite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Formic acid</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">5.33002</td>
			<td>for LC-MS LiChropur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glass bottle for reagents storage</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>S-2070</td>
			<td>50 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Guard column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">959757-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">L-kynurenine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">K8625</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:175px;">Wigo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>ES 21 H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microbalance</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>model XP6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Milli-Q system</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td>ZRQSVPO30</td>
			<td>Direct-Q 3 UV with Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G1948B</td>
			<td>model 6120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Adrich</td>
			<td>048M4874V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:175px;">Bio Tek</td>
			<td></td>
			<td>Synergy 2 operated by Gen5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.05108.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td style="width:175px;">BioRad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">See-saw rocker</td>
			<td style="width:175px;">Stuart</td>
			<td>SSL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipette</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>326001</td>
			<td>5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent inlet filter</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5041-2168</td>
			<td>glass filter, 20 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6524</td>
			<td>1 L, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6526</td>
			<td>1 L, amber glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stir bar</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-2003</td>
			<td>teflon coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for culture medium filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>7-8803</td>
			<td>regenerated cellulose, &#216; 30 mm, 0,45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for mobile phase components filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-0018</td>
			<td>nylon, &#216; 30 mm, 0,22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>96-wells, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrih</td>
			<td>T4049-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:411px;">Ultra-High Performance Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td>
			<td style="width:513px;">1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasound bath</td>
			<td>Polsonic</td>
			<td>104533</td>
			<td>model 6D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td></td>
			<td>model V-1 plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">D120804</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures

La via della cinurenina e i cataboliti di triptofano chiamati kynurenine hanno ricevuto una maggiore attenzione per il loro coinvolgimento nella regolazione immunitaria e nella biologia del cancro. Un saggio di coltura cellulare in vitro viene spesso utilizzato per conoscere il contributo di diversi cataboliti di triptofano in un meccanismo di malattia e per testare strategie terapeutiche. Il mezzo di coltura cellulare ricco di metaboliti secreti e molecole di segnalazione riflette lo stato del metabolismo del triptofano e di altri eventi cellulari. Si desidera nuovi protocolli per la quantificazione affidabile di più cinurenine nel mezzo di coltura cellulare complesso per consentire un'analisi affidabile e rapida di più campioni. Questo può essere realizzato con cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa. Questa potente tecnica è utilizzata in molti laboratori clinici e di ricerca per la quantificazione dei metaboliti e può essere utilizzata per misurare le cinurenine.
Qui è presentato l'uso della cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo (LC-SQ) per la determinazione simultanea di quattro cinurenine, cioè cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido 3-idrossiantranilico e xantiurenico nel mezzo raccolto da cellule tumorali coltivate in vitro. Il rilevatore SQ è semplice da usare e meno costoso rispetto ad altri spettrometri di massa. Nell'analisi SQ-MS, più ioni del campione vengono generati e separati in base al loro specifico rapporto massa-carica (m/z), seguito dal rilevamento utilizzando una modalità SIM (Single Ion Monitoring).
Questo documento richiama l'attenzione sui vantaggi del metodo riportato e indica alcuni punti deboli. Si concentra su elementi critici dell'analisi LC-SQ, inclusa la preparazione del campione insieme alla cromatografia e all'analisi della spettrometria di massa. Vengono inoltre discussi il controllo di qualità, le condizioni di calibrazione del metodo e i problemi relativi agli effetti della matrice. Abbiamo descritto una semplice applicazione della 3-nitrotirosina come uno standard analogico per tutti gli aaliti bersaglio. Come confermato da esperimenti con ovaie umane e cellule tumorali del seno, il metodo LC-SQ proposto genera risultati affidabili e può essere ulteriormente applicato ad altri modelli cellulari in vitro.

LC-MS presenta indiscutibili vantaggi nella quantificazione di molecole biologicamente attive, anche se alcuni componenti di campioni complessi causano i cosiddetti effetti matriciali e compromettono la ionizzazione degli aaliti. Porta alla soppressione degli ioni o al miglioramento degli ioni, diminuendo fortemente l'accuratezza e influenzando un limite di rivelazione /quantificazione della LC-MS, che è considerato un punto "debole" del metodo. Nel nostro protocollo, gli ioni sono generati dalla ionizzazione elettrospr...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures at JoVE.

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Qui descritto è un protocollo per la determinazione di quattro diversi metaboliti del triptofano generati nella via della cinurenina (cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido xanturenico, acido 3-idrossiantranilico) nel mezzo raccolto dalle colture cellulari tumorali analizzate dalla cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

simultaneous-quantification-selected-kynurenines-analyzed-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.3K Views.  The John Paul II Catholic University of Lublin. Qui descritto è un protocollo per la determinazione di quattro diversi metaboliti del triptofano generati nella via della cinurenina (cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido xanturenico, acido 3-idrossiantranilico) nel mezzo raccolto dalle colture cellulari tumorali analizzate dalla cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Ricerca

Bioingegneria

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Un microcontrollore azionato il dispositivo per la generazione di estratti liquidi da Aerosol elettronico e fumo di sigaretta sigaretta convenzionale

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...