The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

Tutti gli esperimenti su campioni di tessuto o di sangue umano devono essere approvati da un comitato etico e condotti secondo linee guida fornite nella votazione etica. 1. Cellular Enrichment <ol><li> Tumori liquidi / fluorescenza-attivato ordinamento cellulare. <ol><li> Isolare cellule mononucleari di midollo osseo o campione di sangue effettuando eritrociti lisi con cloruro di ammonio o Ficoll densità gradiente di centrifugazione. <ol><li> Per eritrociti lisi, unire 1 ml di campione con 4 ml di soluzione di cloruro di ammonio. Incubare la soluzione su ghiaccio per 5 - 10 min. Aggiungere 40 ml di tampone fosfato salino (PBS) di siero fetale bovino + 2% (FCS) e centrifugare per 5 min a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Per Ficoll centrifugazione in gradiente, strato di 10 ml di campione di 15 ml di Ficoll-Hypaque per formare 2 strati distinti (attenzione a non disturbare gli strati). Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente (15 - 25 ° C) accuratamente e raccogliere il mononuclearecellule che raccolgono all&#39;interfase. </li><li> Spin giù le cellule e portarli in PBS + 2% FCS. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti e prendere in 1 ml di PBS + 2% FCS. Prendere una frazione come controllo negativo e un&#39;aliquota di ciascun colorante fluorescente utilizzato nella macchia finale. </li></ol></li><li> Incubare con anticorpi fluorescenza marcati utili per isolare la popolazione di cellule leucemiche in diluizione secondo le istruzioni del produttore su ghiaccio per 30 min. Macchiare anche le aliquote utilizzate per la compensazione con ogni anticorpo individualmente. Lavare due volte con PBS + 2% FCS. NOTA: Gli anticorpi utilizzati erano topo anti-umana contro CD117-PE (Clone 95C3), CD34-FITC (Clone 8G12) e CD33-PE (Clone P67.6). </li><li> Celle filtranti attraverso 35 micron filtro cellule, preferibilmente utilizzando tubi con filtro cella integrati in cap. </li><li> Aggiungi macchia vitalità cellulare (ad esempio, 7-AAD). Ordina cellule utilizzando un cell sorter adeguata 11 (Figura 2). Raccogliere le cellule a Isc<html> Modified Dulbecco del ove Medium (IMDM) contenente il 10% FCS. </li></ol></li><li> Tumori solidi / laser-capture di microdissezione. <ol><li> Per gli esperimenti descritti, sono stati utilizzati campioni FFPE provenienti da campioni di cancro ai polmoni. Per questo tessuto tumore polmonare scopo è stato immediatamente fissato in 4% formalina tamponata dopo la resezione chirurgica e pezzi di circa 3 x 2 x 1 cm dove inclusi in paraffina per ulteriori analisi. </li><li> Tagliare sezioni di 5-10 micron di spessore dal incluso in paraffina (FFPE) campione fissato in formalina con un microtomo. Sezioni Montare su vetrini membrana film coperto e asciutto, a 37 ° C per 1 ora. Deparaffinare e reidratare le sezioni montati mediante incubazione successive in xilene, etanolo assoluto, il 70% e di acqua, ciascuno per 1 min. </li><li> Colorare le sezioni con Ematossilina per 20 secondi e poi sciacquare con acqua di rubinetto. Raccogliere la popolazione di cellule utilizzando un sistema microdissezione laser cattura (vedi anche 12). </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 2. Estrazione proteine <ol><li> Tumori liquidi. <ol><li> Centrifugare la sospensione cellulare dal punto 1.1.5 a 400 xg, 4 ° C per 4 minuti e scartare il surnatante. Lavare due volte con 500 microlitri di PBS freddo e centrifugazione per 5 min a 400 xg e 4 ° C </li><li> Aggiungere 40 microlitri tampone di lisi per 10 6 cellule e incubare per 15 min in ghiaccio (10 5 cellule (circa. 10 mg di proteine ​​totali) dovrebbe essere il minimo numero di cellule). Centrifugare il lisato a 14000 xg, a 4 ° C per 10 min e trasferire il surnatante (lisato cellulare cancellato) in un tubo di reazione. Eliminare il pellet. </li></ol></li><li> Tumori solidi. <ol><li> Aggiungere 60 ml di tampone di lisi tessuto al tessuto microdissezione e incubare per 15 min in ghiaccio, raccogliere il fluido dal breve centrifugazione e trasferire la sospensione in un tubo di reazione. Sonicare il lisato in ghiaccio per 3 min. </li><li> Aggiungere 15 ml di 20% sodio dodecil solfato (SDS) a raggiungere un finale SDS concentration del 4%. Incubare il tessuto microdissezione a 99 ° C su una piastra riscaldante per 1 ora e agitato a 600 rpm. Centrifugare il lisato a 16.000 xg, 18 ° C per 10 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li></ol></li></ol> 3. Istituzione di un SILAC Spike-in Quantificazione standard (Super-SILAC Standard) NOTA: Lo standard quantificazione è costituito da una miscela di proteine ​​SILAC marcata derivata 4-6 cellule linee corrispondenti al tipo di tumore di interesse. Per ottenere la massima sovrapposizione tra il proteoma di riferimento SILAC marcato e il proteoma del tumore di derivazione, una analisi delle componenti principali deve essere eseguita prima di linee cellulari vengono selezionati per lo standard quantificazione 14. <ol><li> Analisi delle componenti principali (PCA). <ol><li> Per determinare i pattern di espressione proteica di linee cellulari, coltivare una decina di diverse linee cellulari in mezzi appropriati di coltura cellulare. Lyse le cellule come descrittoal punto 2.1. Preparare lisati cellulari per spettrometria di massa come descritto al punto 6.1. </li><li> Analizzare il pattern di espressione proteica di ciascuna linea cellulare su una ad alta risoluzione, cromatografia liquida accoppiata spettrometro di massa (nanoLC-MS / MS). </li><li> Analizzare i dati grezzi risultanti utilizzando un software MaxQuant gratuito ed effettuare un&#39;analisi dei principali componenti utilizzando il software associato, come Perseo 16,17. </li><li> Selezionare 4 - 6 linee di cellule che mostrano la più grande diversità tra i loro profili di espressione proteica e le usano per generare il livello picco-in Super-SILAC. </li></ol></li><li> SILAC-etichettatura e controllo etichetta. <ol><li> Coltivare le linee cellulari selezionate per almeno cinque cicli cellulari in appropriato terreno di coltura cellulare SILAC, in cui arginina e lisina sono etichettati con isotopi stabili di carbonio e azoto (media SILAC) 4. </li><li> Lyse le cellule come descritto al punto 3.1 e preparare lisati cellulari per spettrometria di massa come descritto al punto 6.1.Misurare l&#39;efficienza incorporazione di etichettatura SILAC da nanoLC-MS / MS. Analizzare i risultanti dati grezzi MS con MaxQuant e determinare l&#39;efficienza di SILAC etichettatura. Ciò si ottiene contando il numero di peptidi identificati nella loro etichettati (pesante) e loro forme endogene (luce), e calcolando il rapporto (pesante) / (luce pesanti +). Efficienza etichettatura deve superare il 98%. </li></ol></li><li> Combinazione di proteomi SILAC e validazione. <ol><li> Coltivare e ampliare le linee di cellule selezionate in base alle istruzioni produce circa il corretto medio SILAC. Lisare le cellule come descritto al punto 2.1 per tumori liquidi o come descritto al punto 3.2 per tumori solidi e determinare la concentrazione di proteine ​​per ogni lisato cellulare. </li><li> Mix di proteine ​​equimolari quantità di ciascuna linea cellulare e dividere il composto in aliquota. Snap-congelare le aliquote e conservare a -80 ° C fino a quando la misura. Per un esperimento è necessario 20 - 50 mg di standard di Super-SILAC. Fare attenzione a preparare la standard in eccesso come cambiare la norma all&#39;interno di una serie di esperimenti deve essere evitato. </li></ol></li></ol> 4. Misura di proteine ​​Concentrazione e Spike-in <ol><li> Tumori liquidi. <ol><li> Utilizzando proteine ​​test quantificazione determinare le concentrazioni di proteine ​​dei rispettivi lisati cellulari e lo standard Super-SILAC. </li><li> Mescolare pari quantità di lisato cellulare eliminato e lo standard Super-SILAC e successivamente aggiungere litio dodecil solfato (LDS) tampone (25% del volume del campione) e agente riducente (10% del volume del campione). </li><li> Riscaldare la soluzione risultante in un blocco di riscaldamento a 72 ° C per 10 min. Facoltativamente, memorizzare le proteine ​​denaturate risultanti a -80 ° C. </li></ol></li><li> Tumori solidi. <ol><li> Per la misurazione della concentrazione di proteine ​​su un lettore di piastre, mescolare uno standard di albumina sierica bovina (BSA) Serie soluzione di diluizione, il lisato e lo standard Super-SILAC con una proteina disponibile in commercio unssay in una piastra a 96 pozzetti e agitare per 1 min, incubare per tempo indicato e misurare l&#39;assorbanza come indicato dal produttore. NOTA: L&#39;elevata concentrazione di SDS e ditiotreitolo (DTT) nel lisato è un problema per la maggior parte dei saggi per la determinazione della concentrazione proteica. </li><li> Mescolare pari quantità di lisato chiarificato e lo standard Super-SILAC con 200 microlitri di urea nell&#39;unità filtro e centrifugare a 14.000 xg per 30 min a 20 ° C. Non utilizzare più di 50 ml di lisato chiarificato e lo standard Super-SILAC. Evitare temperature inferiori ai 15 ° C, in modo che l&#39;urea non cristallizza out. </li></ol></li></ol> 5. La separazione del campione e proteine ​​Digest <ol><li> Tumori liquidi. <ol><li> Indipendente 30-100 mg di proteine ​​totali per corsia su un 4 - gradiente gel SDS-PAGE 12%. Proteine ​​Macchia con Coomassie Blu O / N. Rimuovere l&#39;eccesso macchia Coomassie da due successivi lavaggi con acqua. </li><li> Tagliare ogni corsia dal gel e dividerloin 23 fette di dimensioni uguali a prescindere dal modello di gel di colorazione. Elaborare le fette di gel separatamente, ciascuno in un in 0,6 ml polipropilene flaconcino. </li><li> Lavare le fette di gel con acqua e metanolo / acqua (50:50, v / v), ridurre con DTT 10 mM incubando per 30 minuti a 56 ° C. Alchilata le fette di gel con 55 mm iodoacetamide (IAA) incubando a 60 min a RT in scuro. </li><li> Tra passaggi-campione manipolazione, lavare le fette con acetonitrile per 15 minuti e secco in un SpeedVac per rimuovere l&#39;eccesso di solvente e di migliorare l&#39;assorbimento di soluzione reagente. </li><li> Eseguire proteasi clivaggio da reidratazione fette gel essiccato con la minima quantità di soluzione di tripsina porcina (12,5 ng / ml in 0,025 M di bicarbonato di ammonio acquoso) per 16 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungere acqua 10 ml di fetta gel e incubare per 15 minuti a 37 ° C. Aggiungere 80 microlitri acetonitrile e incubare per 15 minuti a 37 ° C. Centrifugare a 15.800 xg, per 1 min. Raccogliere il surnatante e conservare in separata 0,6 mltube. </li><li> Aggiungere 65 ml di 5% soluzione di acido formico, vortex e incubare per 15 min a 37 ° C. Aggiungere 65 microlitri acetonitrile e incubare per 15 minuti a 37 ° C. Centrifugare a 15.800 g per 1 min. Raccogliere il surnatante e aggiungere al supernatante dal passaggio precedente. Evaporare il surnatante combinato a secchezza in un concentratore a vuoto. </li></ol></li><li> Tumori solidi. <ol><li> Per rimuovere SDS dal lisato tissutale utilizzare il seguente protocollo FASP, anche descritto come riferimento 15. </li><li> Dopo la prima centrifugazione descritto al punto 5.2.3 aggiungere altri 200 ml di 8 M urea sul filtro, e in seguito centrifugare a 14.000 xg per 20 min a 20 ° C. Gettare il filtrato a flusso continuo. </li><li> Aggiungere 100 microlitri IAA e mescolare in un Thermomixer a 600 rpm per 1 min. Incubare il filtro per 20 min a 20 ° C al buio. Centrifugare il filtro a 14000 xg per 10 min a 20 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di urea al filtro e centrifuge a 14.000 xg per 15 min a 20 ° C. Ripetere questo passaggio ancora una volta. </li><li> Aggiungere 100 ml di NH 4 HCO 3 al filtro e centrifugare a 14.000 xg per 10 min a 20 ° C. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Aggiungere 40 ml di NH 4 HCO 3 + 1 ml (= 0,4 mg) tripsina e mescolare in thermomixer a 20 ° C per 600 rpm, 1 min. Incubare il filtro O / N in una camera umida a 37 ° C. Trasferire il filtro di nuovi tubi di raccolta. </li><li> Centrifugare il filtro a 14000 xg per 10 min a 20 ° C. Aggiungere 50 ml di NH 4 HCO 3 e centrifugare il filtro a 14.000 g per 10 min a 20 ° C. Conservare i peptidi risultanti a -20 ° C fino a quando la misura spettrometria di massa. </li><li> Per la misurazione della concentrazione del peptide, erogare 50 microlitri della risultante flusso continuo e una serie di diluizioni appropriate di triptofano ordinata in una piastra a 96 pozzetti. Misurare la fluorescenza del triptofano. Convertire la concentrazione risultantetriptofano a concentrazione peptide, come 0,1 mg di triptofano corrisponde a 9 mg di proteine. </li></ol></li></ol> Analisi 6. cromatografia liquida e la Messa spettrometrica <ol><li> Riprendere peptidi in tampone di caricamento 30 microlitri per 5 minuti in un bagno di sonicazione. Spin giù in una centrifuga a 15.800 xg per 1 min e pipetta la soluzione limpida in un flaconcino di MS campionatore automatico. </li><li> Iniettare 5 ml di campione per l&#39;analisi utilizzando il campionatore automatico del sistema nanoLC-MS / MS. Concentrato e peptidi desalt online su un fase inversa C18 pre-colonna (0,15 millimetri ID x 20 mm con 5 micron dimensione dei pori materiale C18) montato sia in una configurazione di colonna ventilato o una configurazione di commutazione precolonna. </li><li> Peptidi separati su una fase inversa C18 microcolonna (0,075 millimetri ID x 200 mm auto-compresso con 3 micron o più piccolo dei pori del materiale formato C18 in una colonna nanospray auto-pack come PicoFrit, con un 90 min pendenza 5&gt; 35% acetonitrile vs . 0,1% soluzione di acido formico a 300 nl /min. Trasferire eluente in un quadrupolo ibrido / spettrometro di massa Orbitrap tramite una fonte nanospray ioni. </li><li> Analizzare peptidi con un Top15 dati dipendente metodo di acquisizione (MS m / gamma z 350 -. 1600, risoluzione bersaglio 70.000 FWHM, AGC obiettivo 1 x 10 6, tempo di riempimento max 60 msec MS / MS partenza di massa 100, risoluzione bersaglio 17.500 FWHM, AGC Target 2 x 10 5, tempo max di riempimento 60 msec MS / MS soglia 3 x 10 4, includere stati di carica 2 -. 5, normalizzato Collision Energia NCE 25%, dinamico esclusione 15 sec). </li></ol> Analisi 7. I dati <ol><li> Per l&#39;analisi dei dati utilizzare il software MaxQuant 16 liberamente disponibile. Un protocollo dettagliato per l&#39;analisi dei dati bioinformatica è descritta in 16,17. Per l&#39;analisi, combinare file di dati grezzi provenienti da tutte le sezioni di una corsia di SDS-PAGE in un singolo esperimento 17. </li></ol>

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi o altri problemi di rivelare.

Occorre Mass spettrometria profiling di proteomi cancro cellule derivati ​​da pazienti per la scoperta di nuovi biomarcatori diagnostici / predittivi e per dare una migliore comprensione della biologia del cancro delle cellule, che potrebbe a sua volta portare alla identificazione di nuovi potenziali bersagli farmacologici. Tuttavia, tali analisi di spettrometria di massa sono molto impegnativo, in particolare a causa vari problemi pre-analitiche devono essere risolti, se si vuole ottenere risultati solidi e biologicamente rilevanti. Il flusso di lavoro sperimentale qui descritto consente per la caratterizzazione proteomica quantitativa dei proteomi derivati ​​da sottopopolazioni cellulari di tumori sia liquidi che solidi. È necessaria l&#39;arricchimento iniziale di cellule tumorali o FACS-cell-based sortingor microdissezione per evitare la contaminazione da parte delle cellule del microambiente tumorale. Inoltre, queste tecniche permettono di isolare sottopopolazioni cellulari di interesse. Recenti studi sulle cellule biologiche hanno demonestrata che certe sottopopolazioni cellulari hanno proprietà-tumorali iniziare e sono quindi di grande rilevanza per il cancro patogenesi 19,20. Come spettrometria di massa è diventata più sensibile negli ultimi anni, le analisi quantitative proteomica sono possibili per le piccole quantità di proteine ​​che possono essere derivati ​​da poche migliaia di cellule, rendendo possibile concentrarsi su popolazioni cellulari funzionalmente rilevanti. Il set-up qui presentata può essere utilizzato per identificare e validare nuovi biomarcatori diagnostici in campioni FFPE. Quindi, promette di bea utile strumento per il miglioramento della diagnostica clinica, in quanto ad oggi non vi è ancora una mancanza di biomarcatori molecolari in numero e qualità sufficiente per molti tipi di cancro. Importanti esempi di diagnosi differenziale difficili, per i quali biomarcatori sono carenti, sono la discriminazione tra cancro polmonare primario da metastasi del polmone, carcinoma cholangiocellular intrapancreatica e adenocarcinoma pancreatico, così come sono diverseziazione di neurofibroma benigni da tumori del nervo-guaina periferiche altamente maligne. Inoltre, noi e altri hanno dimostrato che delucidazione quantitativa delle firme di proteomica può essere utile nello studio della biologia delle cellule del cancro in generale, e per rivelare biomarcatori predittivi della risposta terapeutica in pazienti affetti da cancro 21. Due attuali svantaggi del metodo presentato qui sono i requisiti per svariati processi di lavorazione manuale del campione e la domanda sul nanoLC-MS / MS tempo di acquisizione. Mentre i primi possono essere affrontati spostando preparazione del campione per esempio, i formati da 96 pozzetti e con trattamento robotico, quest&#39;ultimo richiederà un cambiamento nella strategia di acquisizione di massa spettrometria. Una volta sottoinsiemi di proteine ​​bersaglio sono stati identificati che possono essere connessi ad esempio, la classificazione del tumore, prevediamo la progettazione di metodi di spettrometria di massa mirati che forniscono letture quantitativi per questi sottoinsiemi con uno sforzo di separazione notevolmente ridotto, equindi con un tempo di acquisizione corrispondentemente ridotta. Se il tempo di acquisizione richiesto richiesto potrebbe essere ridotto 24-36 ore (tumori liquidi) o 3 ore (tumori solidi) per esempio, 1 ora utilizzando mirati spettrometria di massa e una semplice separazione unidimensionale di peptidi, quindi il guadagno conseguente rendimento potrebbero essere utilizzati per aumentare in modo significativo il numero di repliche biologiche e tecniche esaminate, con corrispondente miglioramento della significatività dei risultati di quantificazione. Approcci di spettrometria di massa mirati sono già dimostrato di essere uno strumento adeguato per la verifica di cancro associato proteine ​​biomarcatori-candidati 22, e sono stati sviluppati per un punto in cui essi mostrano promessa per la validazione o addirittura come un potenziale strumento per l&#39;uso clinico di routine 23 , 24.

Proteomica basata spettrometria di massa è emerso ed è ora una disciplina ampiamente utilizzato in biologia cellulare e della ricerca biomedica traslazionale. I progressi tecnici nel campo hanno permesso di studiare i processi cellulari complessi in linee cellulari e modelli animali, come migliaia di proteine ​​possono essere identificati in un singolo esperimento spettrometria di massa 1,2. Sono stati compiuti progressi simile per l&#39;analisi di numerose modifiche post-come la fosforilazione o ubiquitination, anche se questo richiede di solito i flussi di lavoro su misura per l&#39;arricchimento e l&#39;analisi dei dati per ogni tipo di modifica 2,3. Inoltre, il coinvolgimento delle strategie in materia di etichettatura chimiche e metaboliche, tra cui SILAC, consente accurata quantificazione relativa di proteine ​​e PTM, rendendo questo metodo particolarmente interessante per la scoperta di processi cellulari fondamentali, biomarcatori diagnostici e potenziali bersagli farmacologici nei tumori umani 4. Tuttavia,numerose sfide devono essere superate in materia di analisi proteomica delle principali tumori umani 5. Prima di tutto, i campioni tumorali umane spesso mostrano un elevato grado di eterogeneità cellulare che è dovuto alla presenza di vari tipi di cellule appartenenti al microambiente tumorale, comprese le cellule immunitarie e fibroblasti. In secondo luogo, l&#39;evoluzione clonale porta alla diversità genetica all&#39;interno dei tumori stessi, con conseguente l&#39;esistenza di più sottopopolazioni cellulari con diverse proprietà funzionali. Secondo l&#39;attuale concetto di poche cellule staminali tumorali di essere le forze trainanti dello sviluppo e progressione del cancro, l&#39;analisi proteomica di tali (funzionalmente molto rilevanti) sottopopolazioni cellulari dovrebbe essere di grande importanza per una migliore comprensione dei meccanismi oncogenici rilevanti per l&#39;applicazione clinica 6. In terzo luogo, i profili di espressione proteica quantitativi di grandi serie di campioni sono spesso necessarie per l&#39;identificazione di robusta Biomar clinicakers; questo non può essere realizzato mediante l&#39;etichettatura chimica quali iTRAQ 7, mentre le strategie etichettatura metabolici - basandosi, come fanno, sulla proliferazione cellulare 4 - sono altrettanto inapplicabile. In quarto luogo, la maggior parte dei campioni di tumore solidi disponibili sono fissati in formalina, che complica massa spettrometria proteoma a causa della formazione di legami crociati proteici 8. Infine, la maggior parte dei flussi di lavoro esistenti proteomica richiedono notevoli quantità di campione di trasformazione e di acquisizione dei dati, rendendo l&#39;analisi del numero di campioni rilevanti per la ricerca clinica difficile, e chiedendo nuovo flusso di lavoro paradigmi 9,10. Per affrontare questi ostacoli abbiamo sviluppato un apparato sperimentale che combina sia cella di flusso-citometria ordinamento 11 o laser-capture microdissezione 12,13 per l&#39;arricchimento cellulare con una strategia Super-SILAC 14 per introdurre una norma interna globale per una completa analisi di spettrometria di massa. Utilizzando il metodo qui descritto, è possibile quantificare fino a 8.000 proteine ​​nei campioni tumorali umane derivate da singoli tumori liquidi o solidi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

In analisi approfondite dei proteomi di cellule di cancro sono necessari per chiarire meccanismi patogenetici oncogeni, nonché di identificare potenziali bersagli farmacologici e biomarcatori diagnostici. Tuttavia, i metodi per la caratterizzazione proteomica quantitativa dei tumori di derivazione pazienti e in particolare le loro sottopopolazioni cellulari sono in gran parte mancano. Qui si descrive un set-up sperimentale che permette l&#39;analisi quantitativa dei proteomi di sottopopolazioni di cellule tumorali derivate da tumori liquidi o solidi. Ciò si ottiene combinando strategie di arricchimento cellulari con spettrometria di massa quantitativa basata-Super-SILAC seguita da analisi bioinformatica dei dati. Per arricchire sottoinsiemi cellulari specifici, tumori liquidi vengono prima immunophenotyped mediante citometria di flusso seguita da FACS-cernita; per i tumori solidi, laser-capture microdissezione è usato per purificare sottopopolazioni cellulari specifici. In una seconda fase, le proteine ​​vengono estratti dalle cellule purificate e successivamente agganciato un tumore-specifica,SILAC marcato standard di spike-in che consente di proteine ​​quantificazione. La miscela proteica risultante viene sottoposta a uno elettroforesi su gel o Filtro Aided Preparazione del campione (FASP) seguita da digestione trittico. Infine, peptidi triptici vengono analizzati utilizzando un ibrido spettrometro di massa-Orbitrap, ei dati ottenuti sono trattati con suite di software bioinformatici compreso MaxQuant. Per mezzo del flusso di lavoro qui presentato, fino a 8.000 proteine ​​possono essere identificati e quantificati in campioni derivati ​​da pazienti, e le conseguenti profili di espressione proteica possono essere paragonati tra i pazienti per individuare le firme proteomica diagnostici o potenziali bersagli farmacologici.

Profiling proteomica di tumori liquidi e solidi da pazienti è un approccio promettente per la scoperta di nuovi biomarcatori diagnostici e predittivi. Tuttavia, la procedura di preparazione del campione e la spettrometria di massa sono difficili, a causa della complessità dei campioni e la necessità di quantificazione accurata proteine ​​in grandi serie di campioni. La procedura sperimentale descritta sopra inizia con l&#39;isolamento di cellule di interesse, sia per fluorescenza-attivato cell sorting o laser cattura microdissezione. A questo scopo, le cellule da aspirati di midollo osseo-derivate pazienti o campioni di sangue sono macchiati con anticorpi fluorescenza marcati contro marcatori di superficie definiti di interesse prima di ordinamento basato su FACS e lisi cellulare. Per arricchire sottoinsiemi cellulari da sezioni di tessuto, questi primi devono essere montati su slitte appropriate per consentire laser cattura microdissezione. A questo scopo montare tha sezioni di tessuto su adeguati scivoli membrana e utilizzare un laser-capture microdissector secondo le istruzioni del produttore. Selezione delle aree e le cellule di interesse richiede conoscenze adeguate circa la istomorfologia di tessuto sano e neoplastico. Le cellule estratte vengono poi trasferiti in una provetta di raccolta appropriato. Esperimenti iniziali devono essere eseguite in modo da definire la quantità di tessuto necessaria per l&#39;estrazione di quantità sufficienti di proteina (minimo proteina totale 10 mg) per ogni nuovo tessuto di interesse. Ogni campione microdissezione viene trattato con 60 ml di tampone di lisi tissutale. Per lisi efficace, cellule da campioni di tessuto devono essere sonicato per 3 min e dopo l&#39;aggiunta di 15 microlitri di campione SDS vengono incubati in un thermomixer a 99 ° C per 1 ora per rimuovere reticolazioni proteine ​​formalina-indotta. Centrifugazione finalmente facilitare la raccolta del lisato cellulare cancellato. Per ogni malattia di interest (liquidi e tumori solidi) un adeguato standard di quantificazione Super-SILAC deve stabilire 14. Uno standard appropriati dovrebbe rappresentare più del 90% delle proteine ​​espresse nei campioni di interesse. Per la preparazione di uno standard di quantificazione, linee cellulari relative al tipo di cancro di interesse dovrebbero prima essere analizzati mediante spettrometria di massa per determinare i loro profili di espressione proteica e successivamente analisi delle componenti principali devono essere eseguite. 4 - 6 differenti linee cellulari con modelli di espressione proteica differenziale dovrebbero essere scelti e SILAC-etichettati con arginina &quot;pesante&quot; e lisina. Efficienza etichettatura deve essere controllato da nanoLC-MS / MS e dovrebbe essere superiore al 98%. Successivamente, linee cellulari devono essere lisate nello stesso modo come il rispettivo campione derivato paziente e, successivamente, proteine ​​equimolari quantità di ciascun campione e lo standard picco-in SILAC devono essere miscelati. Un passo fondamentale per precisa proteina quantificazione dei campioni clinici ointeresse f è la miscela accurata di proteine ​​equimolari quantità di campioni derivati ​​da pazienti e il picco-in standard quantificazione SILAC. Per determinare la concentrazione di proteina di lisati derivati ​​da cellule filtrate, possono essere utilizzati vari metodi di quantificazione della proteina. Per lisati cellulari da cellule dei tessuti di derivazione è necessario un test in grado di affrontare con alte concentrazioni di SDS e DTT nel lisato. Concentrazione proteica dei campioni derivati ​​da pazienti e lo standard picco-in SILAC devono essere misurate ogni momento prima combinazione con i rispettivi campioni clinici per garantire la corretta miscela, che è cruciale nel fare anche centinaia di campioni comparabili. Dopo che la miscela di quantità uguali di picco-a campioni standard e lisato, ottenuti da tumori liquidi sono mescolati con LDS, riscaldate in un thermomixer a 72 ° C per 10 minuti e successivamente sottoposti a 1D-PAGE in gel digestione del separato proteine ​​con tripsina. I campioni ottenuti daltessuti sono liberati da SDS e digerito con tripsina utilizzando l&#39;approccio FASP come stabilito dalla Wisniewski et al. 15 I peptidi triptici ottenuti possono essere quantificato misurando la fluorescenza del triptofano, che è di particolare interesse per i campioni di tessuto come la quantità di peptidi rilasciati dal filtro differisce tra il 15% e il 75% rispetto ai valori proteici inizialmente caricati sul filtro. A questo scopo si misura la fluorescenza di triptofano. Il confronto con un appropriato diluizioni triptofano consente la quantificazione dei peptidi, come 1,1 mg di triptofano corrisponde a circa 100 mg di peptide. Se necessario, i campioni provenienti soprattutto dalla lavorazione FASP possono essere pre-purificati su entrambi i suggerimenti palco commerciali o artigianali confezionati con la fase-C18 (RP-C18) materiale rovesciato prima di caricare sul sistema nanoLC / MS / MS 18. Analisi Mass-spettrometria viene eseguito su un alto-Risoluzione, alta sensibilità del sistema spettrometria di massa. In breve, i campioni sono peptidi dissalato preconcentrato su una precolonna RP-C18, e separati su una colonna analitica RP-C18 direttamente accoppiato allo spettrometro di massa. Per raggiungere una sufficiente profondità di analisi, ci avvaliamo sia una combinazione di SDS-PAGE proteina prefrazionamento con 40 min gradienti RP-C18 (per i tumori liquidi) o iniezioni singole con lunghi 2 - 3 hr RP-C18 gradienti (per i tumori solidi trattati da FASP ). MS vengono acquisite ad una risoluzione di 70.000 FWHM o meglio, per consentire la quantificazione accurata di coppie SILAC mediante integrazione del picco profili cromatografici. Per l&#39;identificazione di proteine, un metodo di acquisizione dati dipendente Top15 viene utilizzato per generare un gran numero di peptidi MS / MS per peptidi e identificazione delle proteine. Dai dati grezzi risultanti, l&#39;identificazione delle proteine ​​e la quantificazione si ottengono con database di ricerca con software MaxQuant contro una UniProt Knowledgebase umano Proteome completo database di sequenze 17. Nel software MaxQuant (versione attuale 1.5.0.25) peptidi sono identificati dalla acquisito MS / MS per peptide frammento-matching contro spettri derivata in silico dal database sequenza della proteina. Allo stesso tempo, precursore ione profili isotopiche sono estratti intorno ai tempi di ritenzione cromatografiche, e le loro aree dei picchi integrati vengono utilizzati per la quantificazione relativa della luce: coppie peptidici pesanti generati mediante l&#39;etichettatura SILAC. Identità peptidi e intensità relative vengono poi assegnati alle proprietà delle proteine ​​corrispondenti. Software Perseus (versione attuale 1.5.0.15) viene quindi utilizzato per eseguire un&#39;ulteriore valutazione statistica valle dei risultati di elaborazione MaxQuant, compresi campione a campione confronti, PCA e clustering gerarchico. Utilizzando il setup sperimentale descritto abbiamo identificato e quantificato fino a 8.000 proteine ​​da un minimo di 30 mg di proteine ​​totaliderivate da tumori liquidi. Fino a 2.500 proteine ​​da campioni solidi-tumorali possono essere identificati e quantificati in un approccio di proteomica fucile con un gradiente LC di soli 2 ore, permettendo l&#39;analisi di centinaia di campioni clinici in un tempo relativamente breve. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale. I passi principali di arricchimento cellulari-sottoinsieme, isolamento delle proteine, picco-in dello standard di quantificazione e l&#39;analisi di massa-spettrometria sono indicati per i tumori solidi e liquidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> Figura 2. Cellular arricchimento strategies. FACS ordinamento e LCM. (A) strategia di gating esemplare raffigurante gating su una popolazione di cellule leucemiche CD117 macchiato acquisita da un cell sorter. (B) microdissezione laser di tessuto tumorale solido. Le sezioni di tessuto di 5-10 micron di spessore sono stati montati su film coperti diapositive membrana prima della colorazione. Regione di interessi è stata selezionata manualmente per microdissezione laser. Vengono mostrati sezioni prima microdissezione con la regione di interesse segnato giallo e dopo microdissezione. Una barra di scala di 50 micron è incluso nella figura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> Figura 3. Analisi Cluster di proteomi cancro delle cellule umane. Cluster analysis non supervisionata di prprofili di espressione otein di tumori solidi e liquidi è stata eseguita utilizzando la piattaforma computazionale Perseo. AC - Adenocarcinoma, SCC - carcinoma a cellule squamose, SCC-Met - squamose metastasi da carcinoma della testa e del collo, R - replica tecnica.

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Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Views.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Video: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

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Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identificazione dei<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Inserimenti trasposone nei tumori solidi utilizzando Linker-mediata PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite Uso fluorescente SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.