Le interazioni virus-batteriche possono essere importanti per un'infezione virale di successo e la stimolazione di una risposta immunitaria ospite. Ma attualmente, lo stock altamente concentrato e purificato di norovirus umano non può essere prodotto in laboratorio. Questa tecnica può essere utilizzata con qualsiasi virus che si lega ai batteri, per i quali sono disponibili particelle simili a virus o virus vivi.
Ci permette di quantificare le interazioni tra questi virus e batteri. Inoculare cinque millilitri di mezzo liquido con una singola colonia isolata di Enterobacter cloacae da una piastra di agar direttamente dallo stock di glicerolo congelato. Fai crescere i batteri durante la notte.
Il giorno seguente, trasferire 1,3 aliquote millilitri della coltura in due tubi di centrifuga separati da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per cinque minuti. Rimuovere i supernatanti, quindi lavare i campioni due volte utilizzando un millilitro di 1X PBS sterile per ogni lavaggio.
Centrifugare nuovamente i campioni a 10.000 x g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1,3 millilitri di 1X PBS sterile. A partire da 0,5 millilitri di coltura lavata, diluire serialmente i batteri in 1X PBS da 10 a meno uno a 10 a meno quattro.
Usando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della coltura non diluita lavata e ciascuna delle quattro diluizioni a 600 nanometri. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte in PBS 1X per ciascuna delle diluizioni precedenti. Stendere 100 microlitri delle ultime tre diluizioni per ogni serie su piastre di agar per determinare il numero di unità di formazione della colonia per millilitro per ciascun campione.
Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti. Invertire i piatti e incubarli nell'incubatrice. Dopo aver preparato i reagenti, gli anticorpi e i batteri come descritto nel manoscritto, assemblare tutti i materiali in un armadietto di biosicurezza BSL-2.
Particelle simili a virus per il norovirus umano sono elencate come agenti patogeni BSL-2 e tutto il lavoro eseguito utilizzando VLP deve essere condotto in un armadio di biosicurezza certificato. Aggiungere 10 microgrammi di VPP del norovirus umano a ciascun tubo di batteri e mescolare accuratamente mediante pipettazione. Incubare i tubi per un'ora a 37 gradi Celsius con rotazione costante.
Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi a 10.000 x g per cinque minuti. Aspirare e scartare il supernatante e rimescolare il pellet batterico in un millilitro di PBS. Dopo aver ripetuto i passaggi di lavaggio una volta, centrifugare nuovamente i tubi a 10.000 X g per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet di batteri VLP in 150 microlitri di tampone di blocco del 5%. Un errore comune che si verifica è che i tubi vengono scambiati e viene aggiunto il trattamento sbagliato. Per evitare ciò, disporre tutti i tubi in linee che corrispondono al trattamento corretto e aggiungere un trattamento tutto in una volta ai tubi.
Per ogni campione batterico, preparare 50 microlitri di anticorpi GII di norovirus umano diluiti. Utilizzando il tampone di blocco del 5%, diluire l'anticorpo da uno a 125 per i campioni di E.cloacae. Preparare 50 microlitri di anticorpo isotipo diluito per ogni campione batterico utilizzando gli stessi rapporti di diluizione.
Dividere ogni campione di saggio di attacco in 350 aliquote di microlitri trasferendole in tubi di centrifuga puliti da 1,5 millilitri. Per creare controlli non macchiati, aggiungere 50 microlitri di tampone di blocco alla prima aliquota di ogni campione batterico. Per i campioni macchiati, aggiungere 50 microlitri della diluizione dell'anticorpo GII al secondo set di aliquote.
Creare i controlli dell'isotipo aggiungendo 50 microlitri dell'anticorpo dell'isotipo diluito al terzo set di aliquote. Incubare tutti i campioni sul ghiaccio e al buio per 30 minuti. Quindi centrifugare tutti i campioni a 10.000 X g per cinque minuti.
Scartare i supernaganti e resopendire ogni campione in 150 microlitri di FCSB. Ancora una volta, centrifuga tutti i campioni a 10.000 X g per cinque minuti. Ancora una volta, scartare i supernaganti e resostillare i campioni in 100 microlitri di FCSB.
Dopo aver centrifugato i campioni un'ultima volta e aver scartato i supernaganti, ha rimospendato i campioni in 150 microlitri di FCSB. Trasferire ogni campione in un tubo contenente 400 microlitri di FCSB per un volume totale di 550 microlitri. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius fino a quando non vengono analizzati dalla citometria del flusso.
L'attacco VLP è stato misurato utilizzando la citometria del flusso. In primo luogo, i grafici di densità sono stati utilizzati per eliminare i detriti cellulari, seguiti da successivi grafici a punti per rimuovere doppietti batterici e grumi cellulari. Gli istogrammi rappresentativi dimostrano una mancanza di segnale PE in campioni solo batterici e uno spostamento dell'intensità del segnale PE nei campioni di batteriO VLP rispetto ai controlli non macchiati e isotipi.
Dopo un'ora di incubazione con 10 microgrammi di VLP, la citometria di flusso ha rilevato il legame delle particelle sia a E.colacae che a L.gasseri. Per determinare il limite di quantificazione vincolante per questo saggio, è stata generata una serie di diluizioni dei VPP prima dell'aggiunta ai batteri. La riduzione della quantità di VLP ha comportato riduzioni corrispondenti alla percentuale di batteri legati da VLP.
Conoscere il rapporto virus-batterio e mantenere il rapporto coerente tra gli esperimenti è importante per interpretare i risultati. Mutanti batterici e virali possono essere generati per determinare specificamente le strutture superficiali microbiche che mediano questa interazione. Questa tecnica consente ai ricercatori di rispondere a domande riguardanti circostanze e condizioni che hanno un impatto sulle interazioni norovirus-batteriche, incluso il modo in cui i cambiamenti nel genotipo del virus, le condizioni di crescita batterica e i cambiamenti nelle strutture superficiali batteriche alterano il legame virale.
