Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo immunologico umano, come come avviene la comunicazione tra i leucociti a livello molecolare e cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule T umane non purificate possono essere analizzate ex vivo in un periodo di tempo relativamente breve. A dimostrare questa procedura sarà Henning Kirchgessner, un tecnico del nostro laboratorio.
Iniziare mescolando un millilitro di sangue periferico umano appena estratto con 30 millilitri di tampone di llisi ACK in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo otto minuti a temperatura ambiente, riempire il tubo con PBS per un lavaggio di centrifugazione e rimosogliere il pellet in due millilitri di mezzo di coltura per un'incubazione di 60 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere cinque volte 10 al quinto Staphylococcus aureus enterotoxin B o cellule Raji caricate o scaricate da SEB in 500 microlitri di mezzo di coltura in singoli tubi FACS, seguiti da 650 microlitri di pan-leucociti.
Spin giù le co-colture, e rimospendare i pellet in 150 microlitri di mezzo di coltura fresco per un'incubazione di 45 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, vortice delicatamente le cellule per 10 secondi a 100 giri/min aggiungendo 1,5 millilitri di paraformaldeide all'1,5%. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, interrompere la fissazione con un millilitro di PBS integrato con 1%BSA e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
Rimostrare i pellet in 100 microlitri di PBS più BSA e 0,1% di saponina e aggiungere i campioni di cella a due singoli pozzi di una piastra inferiore a U da 96 porri. Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, centrifugare la piastra e rimescolare i pellet in 50 microlitri di PBS più BSA e saponina contenenti gli anticorpi coniugati al fluoroforo o composti di interesse per un'incubazione di 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in 150 microlitri di PBS più BSA e saponina e rimosogliere il pellet in 60 microlitri di PBS.
Per immaginiamo le celle in base alla citometria del flusso, aprite il software di analisi, controllate il livello del liquido e fate clic su Avvio (Startup) dal menu Strumento (Instrument). Fare quindi clic su Carica e caricare gli esempi nella porta quando richiesto. Sotto la scheda Illuminazione, modificare la potenza del laser di eccitazione con le lunghezze del nanometro appropriate.
Quindi, regolare i cancelli per i canali quattro e 11 e regolare l'area per il canale uno. Per valutare le regolazioni di potenza gating e laser, passare dal menu Visualizza al rispettivo cancello e regolare i cancelli e i poteri laser fino a quando le celle e le coppie di celle non sono visibili. Quindi, nella scheda Acquisizione file definire il nome di esempio e il numero di immagini da acquisire e il gate appropriato per la colorazione CD3 e fare clic su Acquisisci per iniziare l'acquisizione.
Per analizzare le immagini cellulari acquisite, aprire il software di analisi appropriato. Seguendo le istruzioni dell'elenco a discesa Compensazione, produrre una matrice di compensazione e salvare la matrice come comp date ctm. Aprire quindi un file di immagine non elaborati di esempio e applicare il ctm della data comp nella finestra per generare l'immagine compensata e i file di analisi dei dati predefiniti.
Dopo aver aperto i file di immagine compensati, converti le immagini in modalità colore. Regolare le tabelle di ricerca per ottenere colori visibili ottimali nella barra degli strumenti Proprietà raccolta immagini. Aprite Gestione maschere (Mask Manager) dal menu Analisi (Analysis) e definite le celle T selezionando una maschera di soglia del 60% per il canale cinque e riempiendo la maschera per creare la maschera di cella T.
Selezionare Quindi la maschera Valle per il canale due con una larghezza di tre pixel per creare la maschera Valle e combinare la cella T e le maschere Valle per creare la maschera sinapsi della cella T. Per calcolare l'espressione CD3 totale nelle celle T, aprite Feature Manager e create la feature Intensity, T cell, channel five. Per calcolare la quantità totale di F-actina nelle celle T, create la feature Intensità, Celle T, canale sei.
Per valutare la quantità di CD3 nelle sinapsi immunitarie, create la feature Intensità, Sinapsi delle cellule T, canale cinque. Per determinare la quantità di F-actina nella sinapsi immunitaria, create la feature Intensità, Sinapsi delle cellule T, canale sei. Infine, per definire l'arricchimento F-actina e CD3, calcolare i rapporti di F-actina o CD3 rispettivamente nella sinapsi immunitaria e nell'espressione totale della proteina selezionata.
In questi grafici, viene mostrata una panoramica della strategia critica di gating per quantificare l'arricchimento proteico nella sinapsi immunitaria tra le cellule che presentano l'antigene surrogato, o APC, e le cellule T in panleucociti non purificati prelevati da un campione di sangue umano a basso volume. Qui vengono mostrate immagini rappresentative di coniugati T-cell-APC con bassi livelli di CD3 e F-actina all'interno delle loro sinapsi immunitarie in assenza di SEB, mentre questi coniugati T-cell-APC dimostrano un forte arricchimento di CD3 e F-actina in presenza di SEB. In assenza di superantigeno, il 15% delle cellule T presentava un arricchimento sia del CD3 che dell'F-actina alla sinapsi immunitaria, mentre un arricchimento del 29% si osserva in presenza di superantigeno.
Infatti, in assenza di superantigeno, meno del 20% dell'F-actina totale nelle cellule si accumula alla sinapsi immunitaria, con oltre il 30% osservato alla sinapsi in presenza di superantigeno. In particolare, il CD3 si accumula alla sinapsi immunitaria anche in assenza di superantigeno, sebbene questo accumulo sia anche significativamente aumentato dall'aggiunta di superantigeno, dimostrando la forma fisica di questo metodo per quantificare l'accumulo proteico alla sinapsi immunitaria T-cell-APC. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei o sette ore se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere tutti i controlli pertinenti, inclusi i campioni senza superantigeno, poiché l'arricchimento proteico si verifica anche se vengono utilizzati APC senza SEB. Seguendo questa procedura, altri metodi come la microscopia a super risoluzione possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulla struttura fine della sinapsi immunitaria. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle comunicazioni cellulari per esplorare la sinapsi immunitaria negli esseri umani per la ricerca di base, gli studi clinici e la scienza traslizionale.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la zona connettiva T-cell-APC e la sinapsi immunitaria nelle cellule T umane ex vivo. Non dimenticare che lavorare con materiali umani primari può essere pericoloso e che precauzioni come indossare guanti o lavorare in condizioni di biosicurezza di livello due dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
