Presentiamo per la prima volta un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile, di cellule IPS derivate presso Organoidi Cerebellari, e condizioni chimiche definite, utilizzando bioreattori ad uso singolo. Per ottenere cellule per la semina del bio-reattore, aggiungere un millilitro di mezzo di distacco cellulare, ad ogni pozzo di una piastra di sei pozzi di iPSC umani. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sette minuti, fino a quando uno scuotimento delicato stacca facilmente le cellule, dal pozzo.
Utilizzando una micropipetta P 1000, pipettare il mezzo di distacco cellulare, su e giù, fino a quando le cellule non si dissociano in singole cellule. Successivamente aggiungere due millilitri, di mezzo di coltura cellulare completo ad ogni pozzo, questo inattiva la digestione enzimatica. Quindi utilizzare la pipetta, per trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico sterile.
Centrifugare il tubo a 210 volte la gravità per tre minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare nel mezzo di coltura. Contare le cellule usando un emocitometro e una tintura blu di tripano.
Vedi il vaso bioreattore con l'iPSC, ad una densità di 250.000 cellule per millilitro. Inserire il recipiente bioreattore, nell'unità di base universale, in un incubatore a 37 gradi Celsius, 95% di umidità e 5% di anidride carbonica. Per promuovere l'aggregazione iPSC, impostare il tasso di agitazione dell'unità di controllo di base su 27 RPM.
Il primo giorno, con il giorno zero che è il giorno della semina del bioreattore, posizionare il bioreattore e l'unità di base in una cappa di flusso sterile, quindi utilizzare una pipetta sierologica, per raccogliere un campione di millilitro, della sospensione cellulare. Placcare le sospensioni cellulari in un attacco ultra basso, piastra da 24 pozzi. Utilizzare un microscopio per confermare che si sono formati aggregati derivati da iPSC.
In tal caso, catturare le immagini degli aggregati a 40 X o 100 X.Continuare a coltivare l'iPSC e il bioreattore, fino a quando il diametro medio degli aggregati, è di 100 micrometri, quindi sostituire l'80% del mezzo, con MT01 fresco senza inibitore della roccia. Quando gli aggregati, raggiungono i 200-250 micrometri di diametro, lasciare depositare tutti gli organoidi, nella parte inferiore del bioreattore, quindi sostituire tutto il mezzo speso, con il mezzo di differenziazione gfCDM. Posizionare l'unità di base e il bioreattore nell'incubatore e diminuire l'agitazione a 25 giri/min.
Dopo aver rimosso il supernatante dagli organoidi immagazzinati, aggiungere un millilitro di saccarosio al 15% al pellet e mescolare bene ruotando delicatamente. Dopo aver incubato gli organoidi durante la notte, a quattro gradi Celsius, rimuovere la soluzione di saccarosio, quindi aggiungere un millilitro di saccarosio al 15%, gelatina al 7,5% e mescolare rapidamente ruotando delicatamente. Mentre gli organoidi stanno incubando a 37 gradi Celsius riempiono un contenitore di plastica a metà strada con la soluzione di gelatina al 15% di saccarosio al 7,5% e gli permettono di solidificarsi.
Dopo che gli organoidi hanno incubato per un'ora, utilizzare una pipetta Pasteur, per posizionare una goccia della miscela di gelatina di saccarosio organoide, sopra il saccarosio solidificato e la gelatina. Dopo aver aspettato 15 minuti che la goccia si solidifichi, riempire il resto del contenitore di plastica, con più 15% di saccarosio, 7,5% di gelatina, lasciarlo solidificare completamente a temperatura ambiente e quindi incubarlo per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Tagliare la gelatina in un cubo, con gli organoidi al centro, fissare il cubo a un pezzo di cartone, con una goccia di composto OCT, quindi posizionare 250 millilitri di Isopentane, in una tazza da 500 millilitri, riempire un contenitore appropriato, con azoto liquido.
Utilizzando forcep e guanti spessi, posizionare con cura la tazza di Isopentane, sulla superficie dell'azoto liquido. Gli azoto isopentane e liquidi sono reagenti pericolosi. L'uso di questi due reagenti richiede dispositivi di protezione individuale, compresi guanti spessi e un'adeguata ventilazione.
Quando l'Isopentane, si è raffreddato a -80 gradi Celsius, posizionare il cubo di gelatina nell'Isopentane fino a quando non si congela. Un cubo ben congelato, produce un suono metallico quando leggermente maschiato con forcep, indicando che è pronto per essere conservato. Lavare i vetrini del microscopio contenenti le sezioni organoidi, con 50 millilitri 1X PBS per cinque minuti, quindi trasferire le diapositive in un barattolo coplin, contenente PBS fresco 1X.
Trasferire le diapositive in un barattolo coplin, contenente 50 millilitri di glicina appena preparata e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire gli scivoli in un barattolo coplin, contenente 50 millilitri dello 0,1% di Tritone, e permeabili per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le diapositive due volte con 1X PBS, per cinque minuti ogni volta. Preparare il piatto immunostaining, con carta da tre millimetri, imbevuto di 1X PBS.
Asciugare gli scivoli con un tessuto tutto intorno alle fette e posizionarli sulla carta da tre millimetri. Con una pipetta Pasteur, coprire ogni diapositiva con 0,5 millilitri di soluzione di blocco. Dopo aver incubato per 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di blocco in eccesso e guidare le diapositive con un tessuto, tutto intorno alle fette.
Posizionare 50 microlitri di anticorpo primario diluito, su ogni diapositiva e coprirli con scivolamenti di copertura. Allagare le diapositive, nel piatto immunostaining precedentemente preparato, e incubarle a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, trasferire le diapositive in un barattolo di Coplin, con 50 millilitri di TBST, lasciando cadere il coperchio, quindi lavare gli scivoli tre volte con TBST, per cinque minuti ogni volta.
Posizionare 50 microlitri, di anticorpi secondari diluiti su ogni scivolo, e coprire con gli scivolamenti di copertura. Posizionare gli scivoli, nel piatto immunostaining precedentemente preparato, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Trasferire nuovamente le diapositive in un barattolo coplin e lavarle tre volte con 50 millilitri di TBST, per cinque minuti ogni volta.
Utilizzando una pipetta Pasteur, a 0,5 millilitri di soluzione dappy, su tutta la superficie di ogni scivolo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo 24 ore nel bioreattore, gli aggregati a forma di sferoide formati in modo efficiente di iPSC. La morfologia è stata ben mantenuta fino al quinto giorno, con un graduale aumento delle dimensioni.
Dimostrando un alto grado di omogeneità. Un'analisi quantitativa per microscopia, ha rivelato anche la distribuzione normale, delle dimensioni aggregate per primo giorno, ed entrambe le linee cellulari hanno raggiunto la dimensione aggregata ottimale per il secondo giorno. Dopo aver raggiunto il diametro aggregato desiderato, è stato indotto l'impegno neurale, e quindi la generazione di diversi progenitori cerebellari è stata promossa.
Durante la differenziazione organoidi, ha mostrato un'epitelializzazione più pronunciata simile alle strutture simili a tubi neurali con spazio luminare. Inoltre, la distribuzione del diametro organoide, era omogenea durante l'impegno cerebellare iniziale fino al giorno 14. L'analisi dell'immunofluorescenza supporta, che un impegno neurale efficiente, degli organoidi derivati dall'iPSC, è già raggiunto, al settimo giorno di differenziazione.
Immunostaining ha anche dimostrato, efficiente impegno cerebellare e maturazione efficiente degli organoidi cerebellari. Inoltre, dopo 80 giorni nel bioreattore, la colorazione morta viva degli organoidi ha mostrato un'elevata vitalità cellulare e nessuna evidenza di aree necrotiche. Questa tecnica rappresenta uno strumento importante, per lo studio delle vie patologiche, coinvolto nella degenerazione del cerebellare osservato in e per valutare l'effetto terapeutico di nuovi farmaci.
