Questo metodo può aiutare a studiare lo sviluppo cerebellare umano precoce e come potrebbe essere alterato nei disturbi neuropsichiatrici. Il vantaggio principale di questo metodo è generare cellule cerebellari umane precoci in una struttura a strati 2D senza eseguire passaggi complicati. È anche efficiente in termini di costi.
Fare pipette di trazione può essere complicato all'inizio, ma con la pratica e il tempo, diventa più facile tirare le pipette in un modo che sarà più facile da lavorare. Inizia la preparazione sperimentale tirando una pipetta Pasteur da 22,9 centimetri a circa due centimetri sotto il collo, sopra il bruciatore bunsen per creare due pipette di vetro. Il lato più sottile sarà circa quattro centimetri più corto dell'altro.
Piegare le punte del lato tirato sulla fiamma per creare una R liscia, quindi posizionare le pipette tirate in manicotti di autoclave e sterilizzarle in un'autoclave. Il giorno zero, aggiungere un millilitro di mezzo di differenziazione cerebellare integrato con 10 micromolari Y-27632 e SB-431542 a ciascun pozzetto di un attacco ultra-basso a sei pozzetti, o ULA, piastra e posizionarlo nell'incubatore fino a quando le colonie sollevate sono pronte per essere aggiunte ai pozzetti. Pulire le celle differenziate utilizzando una pipetta di vetro tirato.
Aspirare il mezzo e aggiungere un millimetro di soluzione di passaggio iPSC per ogni piatto da 35 millimetri. Dopo tre minuti di incubazione a 37 gradi Celsius, aspirare il mezzo e aggiungere due millimetri di terreno di differenziazione cerebellare integrato con 10 micromolari Y-27632 e SB-431542 Sotto ingrandimento 4x di un microscopio invertito a luce trasmessa, sollevare le colonie usando il bordo piegato della pipetta di vetro tirata. Una volta sollevata ogni colonia, trasferire delicatamente tutte le colonie in un pozzetto della piastra ULA a sei pozzetti usando una pipetta sierologica da 10 millilitri.
Ripetere questo processo per ogni piastra iPSC e incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il secondo giorno, aggiungi FGF2 a ciascun pozzetto per regolare una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro. Il settimo giorno, cambiare un terzo del mezzo aspirando un millilitro di mezzo esaurito e sostituendolo con un millilitro di mezzo di differenziazione cerebellare fresco.
Incubare i corpi embrioidi per sette giorni. Il giorno 14, ruota la piastra per raccogliere tutti i corpi embrioidi al centro della piastra. Quindi inclinare la piastra e aspirare tutto il mezzo esaurito utilizzando un pipetter da 1000 microlitri dal bordo.
Man mano che la quantità media diminuisce, appoggiare lentamente la piastra piatta e continuare ad aspirare, lasciando abbastanza mezzo per evitare di estrarre i corpi embrioidi. Quindi, aggiungere tre millilitri di mezzo di differenziazione cerebellare fresco integrato con 10 micromolari Y-27632. Quindi trasferire i corpi embrioidi usando una pipetta sierologica da 10 millilitri in un piatto rivestito di laminina di poli-L-ornitina.
Il giorno 15, aspirare il mezzo e sostituirlo con un nuovo mezzo di differenziazione cerebellare. Il giorno zero, le colonie di iPSC sono state pulite e sollevate in un mezzo di differenziazione cerebellare contenente SB-431542 e Y-27632 e sono state collocate in piastre di attacco ultra-basse per generare corpi embrioidi. L'aggiunta di FGF2 il secondo giorno e un cambiamento di 1/3 di mezzo il settimo giorno hanno portato a corpi embrioidi che mostrano l'allargamento il 14 ° giorno.
Le cellule hanno iniziato a migrare verso l'esterno dai corpi embrioidi lungo la superficie rivestita il 15 ° giorno. Il cambiamento completo del mezzo di maturazione in terreno di maturazione cerebellare dal 21 ° giorno ha portato a un monostrato di cellule con morfologia e complessità di tipo neuronale entro il 35 ° giorno. L'analisi dell'espressione genica al giorno 35 ha rivelato che le cellule esprimono marcatori progenitori cerebellari precoci come progenitori glutammatergici, ATOH1, progenitori GABAergici, PTF1 alfa e i marcatori cellulari progenitori di Purkinje KIRREL2 e SKOR2.
Inoltre, è stata osservata anche l'espressione del marcatore rombico del labbro OTX2 e SIX3 prevalentemente neuronale anteriore specifico. La marcatura immunofluorescente delle cellule raccolte il 35 ° giorno ha mostrato una colorazione positiva per i marcatori del cervelletto EN2 e PTF1 alfa, il marcatore neuronale beta tubulina III e il marcatore di proliferazione KI67. La colorazione nucleare con 4'6-diamidino-2-fenilindrolo, o DAPI, ha mostrato nuclei cellulari.
Per una differenziazione di successo, è fondamentale iniziare con colonie di iPSC sane e indifferenziate e utilizzare reagenti che siano il più possibile ricostituiti.
