Questo protocollo per l'incapsulamento degli ovociti suini consente di mantenere l'organizzazione sferica dei COC. Ciò impedisce il loro appiattimento e conseguente interruzione delle giunzioni dello spazio tra l'ovociti e le cellule follicolari circostanti. I principali vantaggi dei due protocolli descritti sono che sono facili da usare e consentono un controllo efficace sia della sopravvivenza degli ovocite che delle cellule chemio.
Entrambi i sistemi di coltura sono strumenti preziosi per la ricerca di base in biologia riproduttiva e possono avere rilevanza clinica per un migliore trattamento dell'infertilità. Possono anche essere applicati per lo sviluppo di nuovi metodi biotecnologici e per il miglioramento del bestiame. Dopo aver risciacquato le ovaie, trasferirle in un becher riempito con mezzo HM e conservarle in un'incubatrice a 38 gradi Celsius durante tutte le successive manipolazioni.
Aspirare il liquido follicolare da grandi follicoli suini e centrifugarlo a 100 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, filtrare il supernatante utilizzando una siringa sterile attaccata a un filtro poro a membrana da 0,2 micrometri e bloccarlo a -80 gradi Celsius. Per isolare i COC dai follicoli di medie dimensioni, trasferire da due a tre ovaie in una piastra di Petri sterile di 10 centimetri piena di HM. Tagliare delicatamente la superficie dei follicoli ovarico sporgenti con una lama sterile numero 15 chirurgica, che farà scorrere il liquido follicolare e i COC nella piastra di Petri.
Aspirare il contenuto follicolare con un ago calibro 28 attaccato a una siringa monouso e trasferirlo in un'altra piastra di Petri. Per preparare le piastre di Petri di fecondazione in vitro, aggiungere un millilitro di HM ai pozzi centrali e posizionare da tre a quattro gocce di HM negli anelli esterni. Quindi utilizzare una micropipetta in policarbonato per spostare i COC non danneggiati in gocce di HM negli anelli esterni e risciacquarli brevemente da tre a quattro volte.
Al termine, trasferirli singolarmente nel pozzo centrale. Conservare le piastre di fecondazione in vitro nell'incubatore. Preparare soluzioni trombine e fibrinogene come descritto nel manoscritto testuale.
Il giorno della procedura, scongelare lentamente la soluzione di fibrinogeno sul ghiaccio e portarla a temperatura ambiente proprio prima dell'uso. Mescolare la soluzione di alginato allo 0,5% e la soluzione di fibrinogeno con un rapporto uno a uno per un volume finale di due millilitri e vortice delicatamente la miscela. Riparare le camere di incubazione applicando sottili strisce di pellicola di paraffina ai vetri vetrini del microscopio.
Pipetta 7.5 gocce di microliter della miscela FA sulla diapositiva di vetro rivestita con pellicola di paraffina con distanziali di separazione, posizionando da otto a 10 gocce disposte in due file. Utilizzare una micropipetta per trasferire da tre a cinque COC al centro della caduta fa, insieme a un volume minimo di mezzo di maturazione. Aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di trombina sopra ogni goccia fa per coprirlo.
Non c'è bisogno di mescolarli perché il gel si forma quasi istantaneamente. Coprire la camera di incubazione con uno scivolo di vetro precedentemente preparato, quindi capovolgere la camera e posizionarla in una piastra di Petri di 100 millimetri foderata con carta filtrante umida. Metti la piastra di Petri nell'anidride carbonica del 5% a 38 gradi Celsius per cinque o sette minuti.
Dopo l'incubazione, trasferire ogni capsula FA in un pozzo di una piastra da 96 porri contenente 100 microlitri di mezzo di maturazione. Ogni due giorni sostituire metà del mezzo con un mezzo di maturazione fresco pre-equilibrato. Il COC dell'immagine utilizza un microscopio a luce invertita con ingrandimento 10x.
Dopo aver coltivato i COC per quattro giorni, rimuovere il mezzo di maturazione dai pozzi e aggiungere 100 microlitri di 10 unità internazionali per millilitro di glisato di algenato in DMEM. Lasciare la piastra di coltura nell'incubatore per 25-30 minuti. Rimuovere i COC dalle capsule disciolte.
Lavarli più volte in DMEM, quindi trasferirli sull'anello interno di un piatto di fecondazione in vitro contenente PBS. Fai un letto di cinque grammi di polvere FEP in una piastra di Petri da 30 millimetri. Distribuire una singola goccia di mezzo di maturazione contenente da tre a cinque COC sulla polvere FEP.
Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per assicurarsi che le particelle coprano completamente la superficie della goccia liquida e formino marmi liquidi, o LMS. Preparare diverse piastre di Petri di fecondazione in vitro da 60 millimetri e aggiungere da tre a quattro millilitri di acqua sterile agli anelli esterni per creare una camera di umidità. Raccogliere l'LM formato con una pipetta da 1000 microliter e posizionarlo nel pozzo centrale.
Incubare i marmi per quattro giorni a 38 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Per cambiare il mezzo, applicare 30 microlitri di mezzo di maturazione su ogni LM, il che lo farà diffondere. Quando il contenuto di marmo si dissolve, trasferire i COC rilasciati dal bio-reattore a una goccia di mezzo di maturazione fresco nella piastra di Petri.
Dopo tre o quattro lavaggi in mezzo di maturazione, trasferire i COC, insieme a 30 microlitri di mezzo fresco, sul letto di polvere FEP. Ruotare delicatamente la piastra con un movimento circolare per assicurarsi che le particelle di polvere coprano completamente la superficie della goccia liquida e formino un nuovo LM.Quindi, trasferire l'LM alla piastra di Petri di fecondazione in vitro. Entrambi i sistemi di maturazione in vitro producevano COC con cellule di granulosi strettamente aderenti l'una all'altra e strati intatti di cellule cumuliche.
L'analisi di fattibilità coc ha confermato che sono state raggiunte condizioni di crescita ottimali in entrambi i sistemi di incapsulamento. In entrambi i gruppi sono stati osservati solo siti di ovociti ad alta vitalità. Gli ovociti sono stati immagini con microscopia elettronica a trasmissione.
I mitocondri erano distribuiti uniformemente e avevano una forma simile a un guscio. Solo alcuni di essi erano allungati e il loro raggruppamento era sporadicamente osservato. Il reticolo endoplasmatico era associato ai mitocondri o libero nel citoplasma degli ovocite.
Goccioline liquide apparvero come piccole strutture scure e rotonde, e gli apparati golgi furono emersi con cisterne dilatate. È importante essere precisi e attenti quando si trasferiscono le capsule FA dalla camera di incubazione in piastre di coltura e quando si raccoglie e si trasferisce il formato LM nella piastra di Petri di fecondazione in vitro.
