Questo protocollo spiega la fabbricazione di microperline, che saranno utilizzate per aiutare a controllare il tasso di rilascio e la quantità di amiloide che è una proteina di interesse. Le microperline immobilizzeranno le cellule in un biomateriale adatto e le proteggeranno dall'ambiente circostante, oltre a consentire loro di scambiare sottoprodotti e sostanze nutritive con l'ambiente circostante. L'incapsulamento delle celle utilizzando questa tecnica garantisce uno stretto controllo delle dimensioni dei microperline e del numero di cellulare, e lo facciamo regolando vari parametri di fabbricazione.
Quindi incapsulare le cellule descritte in questo protocollo ci darà più di un rilascio cronico di amiloide da usare sia in vitro che in vivo, e l'idea sarebbe che questo ci darebbe una migliore comprensione dei meccanismi della malattia e ci permetterebbe anche di testare nuovi trattamenti. Questo metodo può essere utilizzato per formulare un sistema controllato e studiare il rilascio di qualsiasi biomolecole per molti tipi di cellule, da solo o in combinazione. Per iniziare, rimuovere un pallone quasi confluente dall'incubatore.
Trattare le cellule con soluzione di tripsiderina-EDTA allo 0,25% e incubare a 37 C per cinque-10 minuti per staccare le cellule. Dopo aver aggiunto il mezzo DMEM/F12, raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 1000 giri/min per cinque minuti.
Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in salina tamponata HEPES per raddoppiare la concentrazione cellulare desiderata finale. In un tubo di centrifuga da 50 millilitri, mescolare questa sospensione cellulare in un rapporto uno a uno con una soluzione alginato di peso e volume del 4% per ottenere una sospensione finale contenente la concentrazione cellulare desiderata in una soluzione di alginato di peso e volume del 2%. Per impostare i parametri di incapsulamento, impostare la velocità della macchina incapsulante sulla velocità massima di estrusione, quindi impostare la tensione e la frequenza.
Per fabbricare le microperline, in una siringa da 20 millilitri, caricare cinque millilitri della sospensione cell-alginate e attaccare una siringa all'incapsulatore. Per avviare l'incapsulatore, attivare il flusso che spingerà la sospensione cell-alginate attraverso l'alimentatore e un flusso di goccioline verrà estruso attraverso l'ugello. Raccogliere il primo millilitro nel becher di scarto per evitare il flusso iniziale non uniforme.
Quindi continuare a eseguire i restanti quattro millilitri permettendo alle goccioline di cadere nel bagno di gelazione del cloruro di calcio. A contatto con il bagno di gelazione, l'alginato nelle goccioline incrocia istantaneamente i collegamenti con gli ioni di calcio nel bagno di gelazione, formando microperline sferiche. Dopo un minuto, rimuovere il becher di gelazione dalla piattaforma magnetica e lasciare riposare le microperline per altri quattro minuti senza agitazione per completare la loro gelazione a temperatura ambiente.
Per recuperare le microperline, utilizzare prima un paio di pinzette sterili per rimuovere eventuali detriti o manufatti alginati di grandi dimensioni. Dopo aver tagliato l'estremità di una pipetta di plastica, utilizzarla per trasferire le microperline dal bagno di gelazione a un filtro a rete da 74 micrometri tenuto su un becher di scarto. Per garantire il successo, tagliamo sempre l'estremità di una pipetta di plastica per evitare di danneggiare le microperline e lo facciamo ogni volta che trasferiamo perline da una nave all'altra dopo l'incapsulamento.
Invertire il filtro a rete su un tubo di centrifuga. Pipettare il mezzo di coltura appropriato su di esso per lavare le perline lungo il tubo e consentire loro di equilibrare in quel mezzo per cinque minuti. Quindi trasferirli in un pallone precedentemente riempito con il mezzo appropriato per l'incubazione e ulteriori esperimenti.
Per valutare la vitalità della cella dopo l'incapsulamento e la coltura, aggiungere la miscela di dissoluzione per interrompere delicatamente le microperline e rilasciare le cellule incapsulate. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare integrato con 5% di anidride carbonica a 37 C per 10 minuti con agitazione delicata. Stimare la vitalità cellulare di queste cellule macchiandole con tripano blu e usando una camera emocitometrica.
Per valutare la stabilità dei microperline, misurare il diametro medio per un campione di ogni popolazione di microperline in un corso di tempo utilizzando un microscopio e un software di imaging. Dopo la preparazione, le microperline alginate uniformi e sferiche sono state generate con successo utilizzando questo protocollo. Dopo un giorno in condizioni standard di coltura cellulare, le cellule 7PA2 incapsulate sono state distribuite uniformemente in microperline.
Quando la proliferazione cellulare 7PA2 è stata testata utilizzando un test MTS, non c'era alcuna differenza significativa tra il comportamento di cellule 7PA2 coltivate con o senza alginato per un periodo di sette giorni. I supporti condizionati analizzati da colture 2D e 3D di cellule 7PA2 hanno rivelato un costante aumento dei livelli di amiloide-beta 1-42 in entrambe le culture. La velocità di rilascio dell'amiloide-beta 1-42 dalle microperline, o coltura 3D, è simile nel profilo a quella rilasciata dalla coltura 2D.
Le cellule 7PA2 incapsulate in microperline alginate possono essere utilizzate efficacemente per il rilascio prolungato di amiloide-beta. Le microperline per l'innesto nel cervello del ratto devono essere abbastanza piccole da essere incorporate senza creare una grande lesione. L'impianto di un tallone scalato millimetro all'interno del cervello per scopi in vivo non funzionerebbe, mentre una microperla fabbricata utilizzando questo protocollo ha una dimensione adatta per l'inserimento all'interno dell'ippocampo del ratto.
Per essere sicuri di avere una distribuzione uniforme delle cellule nel prodotto finale, è importante mescolare accuratamente le cellule nella sospensione di alginato cellulare, e questo garantisce il rilascio uniforme di amiloide da ogni microperla.
