Questo lavoro è stato sostenuto dalla University of Western Ontario, il Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, e una borsa di ER06-02-188 da Ministryof di ricerca e innovazione, Premio ricercatore alle prime armi. MMD è stata sostenuta da un programma di formazione CIHR in riproduzione, lo sviluppo precoce e l&#39;impatto sulla salute (REDIH) Graduate Scholarship.

1 ° GIORNO Preparare le seguenti soluzioni fresche del giorno di raccolta degli ovociti con sterile, acqua distillata come l&#39;acqua GIBCO. Per ridurre la possibilità di contaminazione del DNA, cambiare i guanti spesso e usare puntali con filtro. Tenere tubi angolato lontano quando aperto, e richiuderli tutte le provette quando non in uso. Si raccomanda che le soluzioni sono state rilasciate n +1. 3% agarosio LMP Punto di Fusione 30 mg Low (LMP) Agarose fino a 1 ml GIBCO H 2 O sciogliere a 70 ° C Soluzione di Lisi 8 pl di tampone di lisi 1 ml proteinasi K 1 pl Igepal 10% posto su ghiaccio fino al momento dell&#39;uso 02:01 agarosio: Lysis Solution (10 microlitri per ogni singolo ovocita, l&#39;importo è di 3 ovociti) 20 pl 3% agarosio LMP 10 Soluzione Lysis pl mescolare @ 70 ° C SDS Lysis Buffer (501 pl per singolo ovocita) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7,5 </td><td> 450 microlitri </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td></td><td> 501 microlitri </td></tr></tbody></table> 1. Ovociti Collection <ol><li> Posizionare i ovidotti del mouse sezionati nei media M2, e strappare le ampolle per estrarre il complesso di celle cumulus. </li><li> Separare gli ovociti dal complesso cella cumulo utilizzando 0,3 mg / ml soluzione ialuronidasi una goccia in 30 pl di supporto M2. Conservare gli ovociti in unica soluzione il tempo necessario per rimuovere le cellule del cumulo, in quanto l&#39;esposizione prolungata può danneggiarli. Lavare gli ovociti 3x goccia in 30 microlitri di mezzi di M2, la rimozione di cellule del cumulo periodicamente. </li><li> Rimuovere la zona pellucida con soluzione acida Tyrode. Posizionare gli ovociti in una goccia 30 ml di soluzione, e poi trasferisca ad un altro 30goccia pl, come i supporti realizzati lungo diluire l&#39;acido e ridurre la sua efficacia. Conservare gli ovociti in unica soluzione il tempo necessario per rimuovere la zona, come l&#39;esposizione prolungata può danneggiarli. Nota: una maggiore concentrazione di soluzione acida di Tyrode o pronasi possono essere utilizzati per campioni umani, come la zona pellucida umano è più resistente al trattamento con la soluzione acida Tyrode che il mouse. </li><li> Lavare gli ovociti ancora una volta in un calo del 30 microlitri di supporto M2. </li></ol> 2. Agarose Embedding e Lisi <ol><li> Per eseguire l&#39;incorporamento di agarosio, posizionare la soluzione di lisi su un 70 ° C heatblock. Aggiungere l&#39;agarosio LMP preriscaldato alla soluzione di lisi, producendo un 2:1 agarosio: soluzione di lisi. </li><li> Posizionare un singolo ovocita su un vetrino pulito in minima dei media M2. Raccogliere 10 pl di agarosio: soluzione di lisi in una punta di pipetta, e (sotto un microscopio) delicatamente espellere una piccola quantità (~ 1 pl o meno) sul vetrino, permettendogli di miscelare con la minimaal media. Delicatamente sollevare l&#39;ovocita nella punta della pipetta e mettere tutte le 10 pl in una provetta Eppendorf olio minerale con 300 microlitri in modo che il tallone forma una sfera. Nota: questo processo deve essere fatto abbastanza velocemente, come l&#39;agarosio si indurisce se la temperatura scende un minimo di 5 ° C inferiore a 70 ° C. </li><li> Incubare la provetta in ghiaccio per 10 minuti. Per procedere alla lisi, rimuovere l&#39;olio minerale 300 microlitri e aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi SDS. Incubare per una notte in un bagnomaria a 50 ° C. Nota: soluzione di lisi (Tabella 1) possono anche essere utilizzati per questo scopo. </li></ol> 2 ° GIORNO Preparare le seguenti soluzioni nuove il giorno di mutagenesi bisolfito. Per ridurre le possibilità di contaminazione del DNA, cambiare i guanti spesso e usare puntali con filtro. Tenere tubi angolato lontano quando aperto, e richiuderli tutte le provette quando non in uso. Si raccomanda che le soluzioni sono state rilasciate n +1. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M NaOH </td> &lt;td&gt; 2,4 g di NaOH in 20 ml autoclavato ddh 2 O </td></tr><tr><td> 0,1 M NaOH </td><td> 0,5 ml di 3M in 14,5 ml autoclavato ddh 2 O </td></tr><tr><td> 0,3 M NaOH </td><td> 1,5 ml di 3M in 13,5 ml autoclavato ddh 2 O </td></tr></tbody></table> 2,5 M soluzione di bisolfito <ol class="lalpha"><li> 3,8 g di sodio bisolfito 5,5 ml GIBCO distillata H 2 O 1 ml 3 M NaOH sciogliere @ temperatura ambiente </li><li> 110 mg Idrochinone 1 ml GIBCO distillata H 2 O sciogliere @ 90 ° C (solo per il tempo necessario per sciogliere, mescolare regolarmente) </li></ol> Quando è completamente dissolto, miscelare la soluzione (a) e (b) * Tenere lontano dalla luce * 3. Bisolfito di Mutagenesi <ol><li> Completamente rimuovere il 500 pl tampone di lisi SDS e aggiungere 300 microlitri di olio minerale (~ 20 ore). Qualsiasi tampone di lisi rimanente diluire thagarosio e quando viene riscaldato e il tallone sarà più suscettibile a dissolvere nei passaggi successivi. Procedere con la mutagenesi bisolfito immediatamente, o conservare a -20 ° C per un massimo di 5 giorni. </li><li> Se necessario, rimuovere gli ovociti dal freezer e lasciare scongelare (solo fino al tallone agarosio è relativamente trasparente). Incubare per 2,5 minuti a 90 ° C con blocco termico, dopo che incubare in ghiaccio per 10 minuti. Nota: Non mescolare o agitare, estendere più di 2,5 minuti, o fluttuare temperatura. </li><li> Per eseguire la denaturazione, rimuovere l&#39;olio minerale e aggiungere 1 ml di NaOH 0,1 M ad ogni flick tubo, e capovolgere 5-6 volte. </li><li> Incubare per 15 minuti a 37 ° C a bagno-maria, invertendo ogni 3-4 minuti. Il tallone dovrebbe galleggiare in NaOH. </li><li> Per eseguire il trattamento bisolfito, girare delicatamente il tubo, quindi rimuovere il NaOH e aggiungere 300 microlitri di olio minerale e 500 microlitri soluzione di bisolfito. Incubare la provetta per 3,5 ore a 50 ° C in bagno maria. * Tenere lontano dalla luce * </strong&gt; Nota: Lunghezza di incubazione può essere necessario essere determinata empiricamente per gene di interesse. </li><li> Per eseguire desulfonation, incubare in ghiaccio per 3 minuti, quindi rimuovere l&#39;olio minerale e la soluzione di bisolfito, girare delicatamente e aggiungere 1 ml 0.3 M NaOH. Flick e capovolgere 5-6 volte. </li><li> Incubare per 15 minuti a 37 ° C a bagno-maria, invertendo ogni 3-4 minuti. Il tallone dovrebbe galleggiare in NaOH. </li><li> Lavare i campioni, in primo luogo girare delicatamente, quindi rimuovere il NaOH e aggiungere 1 ml di TE 1x pH 7.5. Agitare per 5-10 minuti a temperatura ambiente (su un agitatore). Spin dolcemente di nuovo, quindi rimuovere il TE 1x. Ripetere questo processo di lavaggio due volte. </li><li> Aggiungere 1 ml autoclavato ddh 2 O. Agitare per 5-10 minuti a temperatura ambiente (su un agitatore). Spin delicatamente, quindi rimuovere la H 2 O. Ripetere ddh 2 O lavaggio due volte. </li><li> Controllare il pH del surnatante, che dovrebbe avere un pH 5,0. Se ancora troppo semplice, sciacquare con H 2 O. Rimuovere tutti i surnatante, lasciando solo l&#39;agarosio siaannuncio. </li></ol> 4. 1 ° e 2 ° Turno di amplificazione <ol><li> Preparare 1 turno PCR ** mix mentre ci si lava ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Primer 10 pM Forward esterno </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> 10 Primer Reverse Outer pM </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 13 microlitri </td></tr></tbody></table> Aggiungi ai Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR perline Far scorrere delicatamente il solido agarosio tallone nel tubo PCR (~ 10 pl) Riscaldare a 70 ° C e mescolare Aggiungere 25 microlitri di olio minerale Totale: 50 pl <ol start="2"><li> Amplificare Nota: Un esempio di condizioni di ciclo per mouse SNRPN è denaturazione per 2 minuti a 94 ° C, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, e 1minuto a 68 ° C, e una fase di allungamento finale 10 minuti a 68 ° C. Ricottura temperatura per 1 turno H19 PCR per il mouse e Peg3 è di 50 ° C. </li><li> Preparare 2 ° turno PCR mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Primer 10 pM Forward interno </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> 10 Primer Reverse pM interna </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 19 microlitri </td></tr></tbody></table> Aggiungi ai Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR perline Aggiungere 5 ul 1 prodotto turno come modello. Riscaldare il prodotto 1 turno a 70 ° C per 1 minuto per ammorbidire l&#39;agarosio. Assicurati di pipettare di sotto dello strato di olio minerale. Aggiungere 25 microlitri di olio minerale Totale: 50 pl Nota: sequenze di innesco nidificate per SNRPN, H19, e Peg3 può essere trovato in Market-sentenza Velker et al 10,12. <ol start="4"><li> Amplificare Nota: condizioni di ciclo per mouse SNRPN è denaturazione per 2 minuti a 94 ° C, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, e 1 minuto a 68 ° C, e un allungamento finale 10 minuti passaggio a 68 ° C 10. Mouse H19 e Peg3 richiedono a 50 ° C temperatura di ricottura per 2 ° turno PCR. </li><li> Come test diagnostico, secondo i campioni circolari può essere tagliato con un enzima di restrizione che è metilazione-specifica o ceppo. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ° Turno del prodotto </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Enzima di restrizione </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 4 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> I prodotti della digestione elettroforesi su un gel di acrilammide 8%. Tutte le fasce eterogenee rappresentano più di un sequeNCE. </li></ol> 5. TA clonazione e PCR Colony <ol><li> Per clonare 2 ° prodotto tondo, primo calore a 70 ° C per 1 minuto per ammorbidire l&#39;agarosio, poi legare nel vettore utilizzando il pGEM-T Vector Promega Sistema (Fisher Scientific Cat # A1360). </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ° Turno PCR </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> pGEMT-EASY vettore </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Ligasi </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Legatura Buffer 2x </td><td> 5 pl </td></tr></tbody></table> Incubare @ 4 ° C in macchina PCR. <ol start="2"><li> Scongelare le cellule competenti di E.coli in ghiaccio per 15 minuti (Zymo Research Corp Cat # T3009). Aggiungere 3 reazione ul legatura a 8 pl E.coli e ligazione incubare in ghiaccio per 15 minuti. </li><li> Shock termico per 40 secondi in un bagno d&#39;acqua 42 ° C,e incubare su ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 60 microlitri mezzo SOC e incubare a 37 ° C per 1 ora (in shaker). </li><li> Mettere tutta la miscela di reazione su un LB / Agar / IPTG / Xgal / Amp piastra e piastra incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Preparare colonia mix PCR </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 pM M13 Forward Primer </td><td> 0,7 pl </td></tr><tr><td> 20 pM M13 Reverse Primer </td><td> 0,7 pl </td></tr><tr><td> 5X Green Go Taq Buffer </td><td> 7,0 pl </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0,7 pl </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi </td><td> 0,28 pl </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 25,62 pl </td></tr><tr><td></td><td> 35 Totale pl </td></tr></tbody></table> Aggiungere 35 microlitri mix PCR Colony maestro in una provetta PCR. Scegli una colonia bianca batterica dalla piastra con una pipetta, e turbinare esso nella reazione PCR. <ol start="6"><li> Amplificazione con denaturazione per 10 minuti a 94 ° C, seguita da 30 cicli di 45 secondi a 94 ° C, 30 secondi a 57 ° C, e 1 minuto a 72 ° C, ed una fase finale di allungamento 10 minuti a 72 ° C. 4 microlitri elettroforesi su un gel di agarosio 1,5%. Invia ~ 30 pl del prodotto PCR per il sequenziamento. Nota: Per ovociti, 5 colonie prodotti di PCR vengono sequenziati. </li><li> Una volta che i risultati si ottengono sequencing, pattern di metilazione può essere letto. Qualsiasi CG originale che è rimasto come un CG è stato metilato, e qualsiasi CG originale che ora è un TG è stato non metilato. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Nel nostro lavoro, abbiamo impresso test di metilazione in singoli ovociti ed embrioni (Figura 1). Dopo amplificazione nested PCR usando primer bisolfitici convertiti, è possibile confermare una conversione da visualizzare una dimensione corretta frammento su gel di agarosio (Figura 2). Un oocita individualerappresenta un allele parentale, e in teoria, ha un modello impressa metilazione. Come tale, secondo turno prodotti di PCR può essere testato per la contaminazione accidentale. Un enzima di restrizione sensibili alla metilazione del DNA (ad esempio HinfI o DpnII) può essere utilizzato per digerire il secondo prodotto tondo PCR per valutare se esso contiene un allele metilata o non metilato (Figura 3). Un C metilato nella sequenza di riconoscimento dell&#39;enzima viene clivato mentre un C non metilato che viene convertito a T non è più riconosciuto dall&#39;enzima ed è tagliato. Ogni campione degli ovociti MII contenente sia metilato e non metilato alleli deve essere scartato, come è indicativo di contaminazione cumulo cellulare (Figura 3). Dopo ligazione e trasformazione, successo colonia amplificazione PCR può essere visualizzato su un gel di agarosio per garantire campioni con la dimensione prodotto corretto vengono inviati per sequenziamento (Figura 4). Infine, la sequenza di cinque cl individualequelli di un ovocita MII dovrebbe produrre cinque schemi di metilazione uguali e identici tassi di conversione nonCpG (Figura 5a). Tutti i campioni che contengono più di un modello deve essere scartato (figura 5b). Poiché ovulati ovociti MII hanno due copie cromosomiche o un corpo attaccato polare, vi è la possibilità di ottenere due schemi analoghi di sequenza (Figura 5c). Si consiglia eliminando i dati da ovociti che hanno schemi di metilazione molto dissimili in quanto la contaminazione delle cellule cumulo non si può escludere. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica del singolo test Mutagenesi bisolfito ovociti. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> I risultati rappresentativi Figura 2. Dal 2 ° turno di amplificazione per SNRPN da cantareLe ovocita MII su un gel di agarosio 1,5%. Lanes 1-4 sono quattro singoli ovociti MII e corsia 5 è un controllo negativo (nessun ovocita). Dimensioni amplicone previsto per SNRPN è di 420 bp. L, scala. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> Risultati rappresentativi Figura 3. Da 2 ° turno metilazione-specifica digestione di restrizione per SNRPN da un oocita singolo MII su un gel di acrilammide 8%. Digestione di restrizione HinfI diagnostica mostra DNA non metilato che ospita una T che abolisce il sito di restrizione (420bp, corsia 1) o DNA metilato che contiene un sito di riconoscimento all&#39;interno C (taglio, 262, 103, e 54 bp, corsia 2). La digestione mostrando sia metilati e non metilato siti di enzimi di restrizione (bande di taglio e non tagliato, corsia 3) sono indicativi di contaminazione cumuli cella. L, scala. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Figura 4. </strong&gt; I risultati rappresentativi per l&#39;amplificazione colonia PCR per SNRPN da un singolo ovocita MII su un gel di agarosio 1,5%. Dimensioni amplicone previsto dopo la legatura del SNRPN nel pGEM-T vector facile e l&#39;utilizzo di M13 in avanti e primers inversa è 656 bp. Lane, 1-8, amplificati da cloni 1-8. Clone 5 ha una dimensione errata amplicone e non dovrebbe essere trasmessa per il sequenziamento. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Figura 5. Rappresentante sequenziamento risultati per SNRPN da un singolo ovocita MII. SNRPN è metilato in ovociti. Cerchi neri indicano CpG metilati. Cerchi bianchi indicano CpG non metilato. Il numero e il posizionamento CpG è rappresentativo di un mouse B6 ceppo femminile. a) i risultati attesi per il sequenziamento SNRPN da un singolo ovocita MII. Solo un singolo filamento di DNA dovrebbe amplificare in tutte le cinque cloni. Ovociti con un modello di metilazione sola e identica non-CpG patter di conversionen dovrebbero essere inclusi nelle analisi (conversione percentuale di non-CpG indicato a destra è stata calcolata come il numero di non-CpG citosine convertiti timina come percentuale del totale non-CpG citosine). b) i risultati di sequenziamento per SNRPN da un singolo ovocita MII alla contaminazione cumulus cell. Notare la diversità tra gli stati di metilazione ed i modelli di conversione che indicano l&#39;amplificazione multipla Strand. c) Sequencing risultati per SNRPN da un singolo ovocita MII con entrambe le copie di cromosomi o di inclusione corpo polare.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo saggio ovocita singolo contiene molti passi con un numero che sono critiche e richiedono particolare attenzione. Il primo è lavaggio ovocita. È particolarmente importante lavare ciascun ovocita più volte in mezzo fresco scende dopo il trattamento ialuronidasi per rimuovere come cellule del cumulo numero possibile. Inoltre, durante il trasferimento di ovociti alla soluzione acida Tyrode per la rimozione della zona pellucida assicurarsi che circonda mezzo è chiaro cellule del cumulo. L&#39;ovocita è molto appi...

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td colspan="4"> Ovociti Collection </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Acida Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Igepal </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Soluzione di Lisi </td></tr><tr><td> Tris pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> COPERCHI </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS Lysis Buffer </td></tr><tr><td> TE pH 7,5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisolfito di conversione </td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio bisolfito (bisolfito di sodio) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Idrochinone </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Basso punto di fusione (LMP) Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> Media M2 </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO Acqua distillata </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclavato bidistillata (dd) l&#39;acqua </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Hot Start Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml lievito tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Verde GoTaq Tampone di reazione </td><td> Professionistamega </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Primers annidati interni ed esterni </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligation </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Vector Facile </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Cloning </td></tr><tr><td> Competenti E.coli cellule </td><td> Zymo Research Corp. </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C e 90 ° C di calore Blocks </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C e 50 ° C bagni d&#39;acqua (42 ° C per le trasformazioni) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sedia a dondolo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR macchina </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single oocyte bisulfite mutagenesis

L&#39;epigenetica comprende tutte ereditarie e le modifiche reversibili alla cromatina che l&#39;accessibilità alter gene, e quindi sono i principali meccanismi per la regolazione della trascrizione genica 1. Metilazione del DNA è una modificazione epigenetica che agisce prevalentemente come un segno repressivo. Attraverso l&#39;aggiunta covalente di un gruppo metilico su citosine in dinucleotidi CpG, può assumere altre proteine ​​repressivi e modifiche istone avviare processi di condensazione della cromatina e il silenziamento genico 2. Metilazione del DNA è essenziale per il normale sviluppo in quanto svolge un ruolo fondamentale nella programmazione dello sviluppo, differenziamento cellulare, la repressione degli elementi retrovirali, inattivazione del cromosoma X e imprinting genomico. Uno dei metodi più potenti per l&#39;analisi della metilazione del DNA è mutagenesi bisolfito. Bisolfito di sodio è un mutageno DNA che deamina cytosines in uracils. Dopo l&#39;amplificazione PCR e seque<html> ncing, questi eventi di conversione vengono rilevati come thymines. Citosine metilate sono protetti da deaminazione e quindi rimangono come citosine, che consente l&#39;identificazione di metilazione del DNA a livello di singolo nucleotide 3. Sviluppo del saggio mutagenesi bisolfito è avanzato da quelli originariamente riportati 4-6 verso quelli che sono più sensibili e riproducibile 7. Un progresso fondamentale è stato l&#39;incorporamento piccole quantità di DNA in un cordone di agarosio, proteggendo in tal modo il DNA dal trattamento bisolfito duro 8. Questa analisi di metilazione in grado di essere eseguita su pool di ovociti e di embrioni allo stadio di blastocisti 9. Il più sofisticato protocollo di mutagenesi bisolfito ad oggi è per i singoli embrioni allo stadio di blastocisti 10. Tuttavia, poiché blastocisti hanno in media 64 celle (contenente 120-720 pg di DNA genomico), questo metodo non è efficace per gli studi sulla metilazione ovociti individuali o clivaggio stadi embrioni. tenda &quot;&gt; Assunzione di indizi da incorporare agarosio di somme di DNA minuto tra cui 11 ovociti, qui vi presentiamo un metodo per cui gli ovociti vengono direttamente incorporati in una soluzione di agarosio e lisi cordone immediatamente dopo il recupero e la rimozione della zona pellucida dell&#39;ovocita dal. Questo ci permette di bypassare le due sfide principali di mutagenesi singolo ovocita: bisolfito. proteggere una piccola quantità di DNA dalla degradazione, e conseguente perdita durante le fasi di protocollo numerosi importante, poiché i dati sono ottenuti da ovociti singoli, il problema del bias PCR in pool Inoltre viene eliminato. , contaminazione accidentale cella cumulo rilevabili mediante questo metodo poiché ogni campione con più di un pattern di metilazione può essere esclusi dall&#39;analisi 12. Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per analisi di successo e riproducibile di metilazione del DNA a livello di singola cellula ed è ideale ovociti per i singoli così come scissione stadio embrioni.

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Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Mutagenesi bisolfito è il gold standard per l&#39;analisi della metilazione del DNA. Il nostro protocollo modificato per l&#39;analisi consente di metilazione del DNA al livello di singola cellula ed è stato specificamente progettato per i singoli ovociti. Può anche essere utilizzato per il clivaggio stadio embrioni.

Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario. Mutagenesi bisolfito è il gold standard per l'analisi della metilazione del DNA. Il nostro protocollo modificato per l'analisi consente di metilazione del DNA al livello di singola cellula ed è stato specificamente progettato per i singoli ovociti. Può anche essere utilizzato per il clivaggio stadio embrioni.

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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Ricerca

Biologia

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Lievito luminometrici e<em&gt; Xenopus</em&gt; ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Generazione di<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...