Questo lavoro è stato condotto nel laboratorio di Richard M. Schultz &#39;s. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Michael Lampson per concettualizzare il centromero-conteggio saggio e l&#39;accesso al suo microscopio confocale. Teresa Chiang e Francesca Duncan assistito ad ottimizzare il centromero-conteggio test. Paula Stein è supportato da HD022681 (a RMS) e Karen Schindler è supportato da HD055822.

1. Topo ovocita collezione <ol><li> Per massimizzare il numero di follicoli antrali isolati gli uni dagli mouse, intraperitoneale iniettare topi femmina sessualmente matura (usiamo di 6 settimane di età CF-1 nei topi da Harlan) con 5 UI di siero di cavalla gravida di gonadotropina (PMSG). </li><li> Preparare il mezzo di raccolta (MEM / PVP) (3 ml / mouse) aggiungendo milrinone a 2,5 micron e riscaldarlo a 37 ° C. Milrinone è un inibitore della fosfodiesterasi che mantiene arresto meiotico, una volta gli ovociti vengono rimossi dai follicoli. In alternativa, 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) (0,2 mm) o dibutyryl-adenosina monofosfato ciclico (dbcAMP) (100 mg / ml) può essere utilizzato. Preparare il terreno di coltura con l&#39;aggiunta di glutamina (1 mm) e milrinone (2,5 mM) a 1 ml di CZB e lasciarlo equilibrare nell&#39;incubatrice per almeno un&#39;ora. Impostare il microgocce di ognuno in una piastra di Petri e sovrapposizione con olio minerale. Il piatto CZB viene messo in incubatrice mentre la MEM / PVP piatto rimane al di fuori di una diapositiva più caldo. Altra raccolta e mezzo di coltura che sono disponibili in commercio (M2 e M16 da supporti speciali o Sigma) sono utilizzati di routine. </li><li> Circa 48 ore dopo PMSG adescamento, il sacrificio del mouse utilizzando CO 2 sedazione seguita da dislocazione cervicale, sezionare le ovaie e metterli in un vetro d&#39;orologio contenente preriscaldata MEM / PVP + milrinone (MEM / PVP + M). </li><li> Utilizzando una siringa da insulina da 1 ml, ancora le ovaie al piatto e rilasciare i follicoli antrali di pungere più volte con 27-gauge (o cucire) aghi che sono fissati insieme. </li><li> Mentre si guarda attraverso un microscopio dissezione, raccogliere complessi cumulo-ovocita usando una bocca a comando pipetta di vetro. E &#39;utile avere un microscopio con un sacco di contrasto. In alternativa, il supporto contenente i tessuti e le cellule possono essere pipettati su un coperchio di un piatto di plastica Petri. Solo raccogliere grandi follicoli antrali e non più piccoli pre-antrale follicoli o ovociti denudati. Una volta raccolti, i complessi trasferimento ad un MicroDrop di MEM / PVP + M che si trova sulla scorrimento più calde e sotto olio. </li><li> Utilizzando una pipetta di piccole dimensioni (leggermente più grande del diametro del ovocita), pipettare su e giù per i complessi di staccare cellule del cumulo. Trasferire gli ovociti denudata con una pipetta in un più ampio MicroDrop di CZB + milrinone (CZB + M) e posto nell&#39;incubatrice. </li><li> Permettono di recuperare gli ovociti per almeno 1 ora in incubatrice prima della manipolazione. </li></ol> 2. Microiniezione ovocitaria <ol><li> Fai pipette iniezione tirando in vetro borosilicato tubo capillare in un estrattore meccanico. Usiamo un Flaming-Brown micropipetta estrattore (modello P-97) con le seguenti impostazioni: P = 500, di calore = 300, Pull = 150, Vel = 100, Tempo = 150. </li><li> Preparare la piattaforma microiniezione mettendo una goccia 5 ml di MEM / PVP + M il più vicino possibile ad una goccia 0,5 ml di materiale iniezione di scelta (siRNA per esempio, cRNA, oligonucleotide morfolino, ecc) su un 1-scivolo e da camera che ha la camera dei media rimosso. Coprire con olio minerale e posto sul palco microscopio (Fig. 1). </li><li> Luogo di iniezione e pipette tenendo nei supporti e la posizione nella goccia di MEM / PVP + M. Accendere i serbatoi di azoto che sono collegati al picoinjector e anti-vibrazioni tavolo. Aprire la punta della pipetta di iniezione con delicatezza toccando contro la pipetta tenendo mentre il riempimento con il mezzo. Se l&#39;apertura è troppo grande, il mezzo si muove dentro e fuori rapidamente e l&#39;ago si uccidono la cellula. Pipette con troppo piccolo di un&#39;apertura spesso intasano facilmente. </li><li> Ovociti trasferimento (5-10) dal termostato al MEM / PVP + M cadere sulla piattaforma. Prima di iniettare, impostare la picoinjector. Noi utilizzare i seguenti parametri sul nostro picoinjector (Modello PLI-100 da Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, tempo = 3s. Ciò si traduce in un volume di iniezione di 5-10 pL. </li><li> Tenendo premuto CLEAR, spostare l&#39;ago per l&#39;iniezione per la caduta di materiale e di riempimento. Restituirlo alla caduta media. </li><li> Utilizzare la pipetta di partecipazione agli catturare un ovocita e allineare l&#39;ago di iniezione, degli ovociti e pipetta tenendo lungo l&#39;asse delle ascisse. </li><li> In alto ingrandimento, far avanzare la pipetta di iniezione attraverso l&#39;ovocita facendo attenzione ad evitare il nucleo. Una volta che la membrana plasmatica è trafitto, premere iniettare. Dopo l&#39;iniezione, ritirare l&#39;ago. Rilasciare l&#39;ovocita e ripetere. Una volta che tutti gli ovociti vengono iniettati, li riporta ai incubatrice. Tenere in CZB + M per quantità di tempo desiderato, questo tempo dipende lo scopo sperimentale (siRNA e cioè knockdown morfolino (fino a 24 ore), l&#39;iperespressione (3-12 h)). Si prega di notare che l&#39;incubazione più lungo di 24 ore sarà compromesso maturazione meiotica. </li></ol> 3. Maturazione degli ovociti <ol><li> Dopo l&#39;incubazione lavare gli ovociti attraverso alcune gocce di CZB (media maturazione) e trasferirlo in una MicroDrop di media stagionatura sotto olio e mettere in incubatrice. </li><li> Consentire 16 h per t completa maturazione<html> o metafase della meiosi II. </li></ol> 4. Ploidia analisi <ol><li> Preparare CZB + monastrol (100 mM) e il luogo 750 microlitri nel pozzetto di un piatto cultura organo che ha l&#39;acqua nell&#39;anello esterno. </li><li> Lavare le uova con alcune gocce di CZB + monastrol e trasferirli nel piatto cultura organo. Posto in incubatrice per 1 h. </li><li> Fissare le uova con il trasferimento in un vetro d&#39;orologio contenente il 2% paraformaldeide in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferimento in un altro vetro d&#39;orologio con il blocco soluzione. Questo piatto può essere conservato a 4 ° C fino elaborati. </li><li> Trasferimento a soluzione permeabilizzazione (PBS + 0,3% di BSA + TritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) in un vetro d&#39;orologio per 15 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare attraverso diversi grandi volumi di soluzione di blocco (PBS + 0,3% di BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> Il resto della procedura viene eseguita sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti in una camera umidificata a temperatura ambiente che è protetta dalla luce. Le gocce (~ 25 mL) sono collocati all&#39;interno delle rientranze circolare. Trasferimento uova a bloccare una soluzione per 15 minuti. </li><li> Per centromeri etichetta, uova trasferimento in una goccia di soluzione contenente il blocco CREST anti-siero a 1:40. Incubare per almeno 1 h. Lavare con 3 gocce di soluzione di blocco, incubare 15 minuti ciascuno. </li><li> Trasferimento uova per una goccia di soluzione contenente il blocco Cy5-o-Alexa Fluor-594-coniugato anti-IgG umane (1:200) e incubare per 1h. Ripetere il lavaggio passi come sopra tranne per l&#39;ultimo passo, includono Sytox Verde (1:5.000) nella soluzione bloccante per rilevare cromosomi. Montare in 5 ml di Vectashield. Per evitare lo schiacciamento delle uova, mettere 4 piccole macchie di vaselina negli angoli di dove il coprioggetto sarà. Collocare un coprioggetto sopra e sigillare con smalto. Conservare in una scatola di scorrimento a 4 ° C fino a quando l&#39;elaborazione tramite microscopia confocale. </li><li> Mentre l&#39;imaging con un obiettivo 100X, cattura 0,4 micron passi nella Z-plane e di immagine dell&#39;intera regione del mandrino metafase. Conte centromeri utilizzando software di imaging come immagine J (NIH). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Figura 2 è un Z-proiezione da un uovo euploid. In metafase di MII, uova euploid topo contengono 20 coppie di cromosomi e quindi hanno 40 centromeri. Occasionalmente cromosomi non riescono a diffondersi nonostante il trattamento monastrol. Questa situazione rende difficile contare affidabile centromeri e quindi non includono queste uova nelle nostre analisi. Occasionalmente, può essere difficile determinare se un CREST-immunoreattive &quot;spot&quot; è di 1 o 2 centromeri. Utilizzando programmi come J immagine è utile perché si può analizzare ogni Z-sezione mentre notando attentamente l&#39;orientamento dei cromosomi, il numero di sezioni in cui viene rilevato un &quot;spot&quot; e l&#39;intensità dei pixel i &quot;punti&quot; hanno. A seconda di dove il fuso meiotico è posizionato rispetto al corpo polare, le regioni del DNA possono sovrapporsi e questi campioni non devono essere inclusi nell&#39;analisi. Non manipolata, in vivo, uova ovulato dai topi riproduttivo giovani hanno bassi tassi di aneuploidia (~ 1-2%). Tuttavia, per motivi non compresi, microiniezione e nelle procedure di maturazione in vitro possono aumentare questo tasso verso l&#39;alto del 10%. Pertanto, è fondamentale che gli ovociti iniettati di controllo sono inclusi in ogni studio microiniezione. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Piatto microiniezione impostare. Una diapositiva da camera con 5 gocce l di MEM / PVP + M appena sopra 0.5μl gocce di soluzione di iniezione. Coprire con olio minerale. In questo esempio ci sono 3 gocce per 3 diverse soluzioni di iniezione e la diapositiva è seduto sul palco di un microscopio. A sinistra si trova l&#39;ago microiniezione e di destra è la pipetta in mano. Notare che vi è un riflesso della porta-aghi. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Risultati ploidia. A Z-proiezione di un uovo euploid metafase II. Il DNA è colorato in verde e cinetocori sono colorati in rosso. Le frecce indicano 2 bracci distinti cromatidi indicando che cinetocori (# 17 e # 18) si sovrappongono. Uova di topo Euploid contengono 20 coppie cinetocoro (40 totale &quot;macchie&quot;). Un uovo aneuploidi conterrebbe alcuna variazione su questo numero. Se questa procedura sono stati condotti su ovociti metafase MI, ci sarebbero 40 paia cinetocoro (80 totale &quot;macchie&quot;). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabella 1"/> Tabella 1. Ricetta per mezzo di raccolta e di microiniezione (MEM / PVP + M). Tutti i materiali sono embrio-cultura grado e di Sigma-Aldrich. Filtro sterilizzare attraverso 0.22μm filtri PVDF (usiamo Stericups Milipore) e conservare a 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; Tabella 2 &quot;/&gt; Tabella 2. Ricetta per le medie CZB. Tutti i materiali sono embrio-cultura grado e di Sigma-Aldrich. Filtro sterilizzare attraverso 0.22μm filtri PVDF (usiamo Stericups Milipore) e conservare a 4 ° C.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Microiniezione degli ovociti è un metodo potente per studiare i meccanismi che regolano la maturazione meiotica 10,11, 12, 13. Questo metodo offre un modo economico per verificare ipotesi prima di effettuare un grande investimento per lo sviluppo di modelli di topi transgenici e mirati. Raccolta degli ovociti e tecniche di microiniezione richiedono più tempo per padroneggiare procedure tipiche di biologia cellulare. Ostacoli specifici con raccolta spesso includono il controllo della pipetta bocca, tirando la corretta dimensione pipetta di vetro per la raccolta e la rimozione delle cellule somatiche e aumentando la velocità di raccolta per ridurre al minimo il tempo in cui gli ovociti sono al di fuori del termostato. Si consiglia di praticare molte volte prima di fare esperimenti. Trasferimento di ovociti tra microgocce pur mantenendo lo stesso numero di cellule è un ottimo modo per familiarizzare con questo metodo. La morte cellulare si verifica comunemente durante l&#39;apprendimento microiniezione. Ciò potrebbe verificarsi per una serie di motivi, tra cui l&#39;iniezione di troppo grande di un volume di materiale (cioè l&#39;apertura ago per l&#39;iniezione è troppo grande), colpendo il nucleo con l&#39;ago di iniezione, il piercing sul lato opposto della ovocita o che il materiale iniettato è tossico per l&#39;ovocita. Pratica con l&#39;iniezione di buffer in ovociti fino a quando il tasso di sopravvivenza è almeno del 50% è la chiave per padroneggiare questa tecnica. Se gli ovociti non riescono a maturare, è probabile che il milrinone non è stato diluito abbastanza. Si consiglia il risciacquo degli ovociti attraverso molti grandi gocce di milrinone senza CZB prima maturazione. La ploidia microiniezione seguente analisi è uno dei tanti test per valutare la maturazione meiotica. Altre analisi di routine che usiamo in laboratorio comprendere il controllo della cinetica con cui il progresso ovociti attraverso la meiosi, immunofluorescenza per analizzare la formazione del fuso e l&#39;allineamento dei cromosomi e l&#39;attivazione uovo o la fecondazione in vitro per valutare le conseguenze dello sviluppo della manipolazione dell&#39;ovocita 14,15, 16, 17.

Tabella di reagenti specifici: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Risospendere in DMSO a 2,5 mm </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Utilizzare solo embrione testato, sterile, filtrata </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umana Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Laboratori Vector </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina da siero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Risospendere in DMSO a 100mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella di attrezzature specifiche: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome delle apparecchiature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Boccaglio </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Vetro d&#39;orologio </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 millimetri Petri Dish </td><td> Falco </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Pasteur in vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lato più caldo </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td></td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Camera di diapositive </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi capillari </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> Microcaps </td></tr><tr><td> Pipetta Puller </td><td> Flaming-Brown micropipetta estrattore </td><td></td><td> Modello P-97 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Micromanipolatori </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modello PLI-100 </td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> CO 2 serbatoi </td><td></td><td></td><td> Per incubatore </td></tr><tr><td> N2 serbatoio </td><td></td><td></td><td> Per la tavola e iniettore </td></tr><tr><td> Antivibranti tavolo </td><td> Produzione tecnico </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td></td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Pipette tenendo </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Strumenti di dissezione </td><td> Strumenti della scienza multa </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Camera umidificata </td><td></td><td></td><td> Noi usiamo tupperware </td></tr><tr><td> Coperchio della piastra da 96 pozzetti </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Thomas scientifica </td><td> 6663-F10 </td><td> Lo spessore varia per microscopi particolare </td></tr><tr><td> Centro ben organo piatto cultura </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

Gli errori nella segregazione dei cromosomi portare a cellule aneuploidi. Nelle cellule somatiche, aneuploidia è associata con il cancro, ma in gameti, aneuploidia porta alla sterilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Gameti aploidi forma attraverso la specie-specifici programmi di sviluppo che sono accoppiati a meiosi. La prima divisione meiotica (MI) è unica per meiosi perché cromatidi fratelli restano attaccati mentre cromosomi omologhi sono segregati. Per ragioni non pienamente compreso, questa divisione reductional è incline ad errori ed è più comunemente la fonte di aneuploidia di errori nella meiosi II (MII) o di errori in 1,2 meiosi maschile. Nei mammiferi, l&#39;arresto ovociti in profase di infarto miocardico con un grande vescicola germinale intatto (GV, nucleo) e solo riprendere la meiosi quando ricevono segnali ovulatorio. Una volta riprende la meiosi, MI ovociti completa e sottoposti ad una divisione cellulare asimmetrica, arrestando di nuovo in metafase di MII. Le uova non si completerà MII finché non vengono fecondati dagli spermatozoi. Ovociti possono anche subire la maturazione meiotica utilizzando stabilito in condizioni di coltura in vitro 3. Poiché la generazione di mutanti di topi transgenici e geni-bersaglio è costoso e può richiedere lunghi periodi di tempo, la manipolazione dei gameti femminili in vitro è una strategia più economico e risparmio di tempo. Qui, descriviamo i metodi per isolare profase arrestato ovociti di topo e per la microiniezione. Qualsiasi materiale di scelta possono essere introdotti nel citoplasma dell&#39;ovocita, ma perché meiotically-competente ovociti sono trascrizionalmente silente cRNA 4,5, e non il DNA, deve essere iniettato per gli studi di espressione ectopica. Per valutare la ploidia, descriviamo le nostre condizioni per la maturazione in vitro degli ovociti MII alle uova. Storicamente, cromosoma-tecniche di spandimento sono usati per contare il numero cromosoma 6. Questo metodo è tecnicamente impegnativa ed è limitata solo a identificare hyperploidies. Qui, descriviamo un metodo per determinare ipo-e hyperploidies utilizzando uova intatte 7-8. Questo metodo utilizza monastrol, un inibitore della chinesina-5, che crolla del fuso bipolare in un mandrino monopolare 9 cromosomi separando così in modo che cinetocori individuo può essere prontamente individuato e contati utilizzando un siero anti-CREST autoimmuni. Poiché questo metodo viene eseguito nelle uova intatte, i cromosomi non sono persi a causa di un errore dell&#39;operatore.

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Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Views.  University of Pennsylvania. Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.

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Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

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Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

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Ricerca

Biologia

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolamento dei cardiomiociti da cuori fissi per l'immunocitochimica e l'analisi dello ploidy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...